砂生槐根瘤内抗小麦纹枯病生防菌株的筛选及其鉴定

何建清，张格杰，赵伟进，王孝先

(西藏农牧学院，西藏林芝 860000)

小麦纹枯病(Rhizotoniacerealisvan der Hoeven apud.Boerema & Verhoeven)又称立枯病、尖眼斑病，是由禾谷丝核菌(Rhizotoniacerealis) 引起的一种土传真菌病害[1-2]，其分布范围甚广，早在 1934 年即有报道。小麦纹枯病对小麦产量影响较大，发病时一般减产10%～20%，严重时减产50%左右，甚至造成枯孕穗、枯白穗，造成颗粒无收[3-4]。近年来，由于气候变暖、耕作、栽培制度变化等原因，小麦纹枯病的发生和为害日益严重，已成为我国小麦高产、稳产的主要障碍之一[5-6]。由于目前尚未发现高抗纹枯病的小麦品种，控制该病害仍主要依靠苯醚甲环唑和戊唑醇处理种子并于春季结合井冈霉素进行化学防治[7]。由于长期单一用药，已使小麦纹枯病菌对常用杀菌剂产生了不同程度的抗药性，防治效果明显降低[1]。因此，探索可替代化学防治的防治方法迫在眉睫。目前，以植物微生态学为基础控制有害生物的防治技术已成为小麦纹枯病防治研究的热点[8-9]。

植物内生菌与植物在长期协同进化过程中形成了互惠互利、相互依存的关系。植物内生菌已成为植物微生态系统中的重要组成部分[10]。对根瘤菌与豆科植物共生关系的研究发现，根瘤中同时定殖着许多与根瘤菌不同的内生菌，其中一些非共生细菌不引起植物病害，为根瘤内生细菌[11]。研究表明，根瘤内生菌具有生物固氮、促进植物生长、增强宿主抗逆、抗病能力等功能[12]。近年来，已有利用豆科植物根瘤内生菌防治植物病害、促进植物生长的研究[13-16]。

砂生槐[Sophoramoorcroftiana(Benth.) Baker]又名西藏狼牙刺、刺柴、金雀花等，藏语名“吉瓦”，为豆科槐属多年生矮灌木，是青藏高原特有种[17]。砂生槐主要分布在雅江流域中段的宽谷、两侧低山及拉萨河、年楚河等主要支流的宽谷内，具有良好的防风固沙、涵养水源等重要生态作用[18]。目前对砂生槐的研究主要集中在种群和群落结构、繁殖特性、固沙特性和物种多样性等方面[19-21]，尚未见从砂生槐根瘤中筛选植物病原菌拮抗内生细菌的研究。本研究拟从砂生槐根瘤中分离、筛选对小麦纹枯病菌的拮抗细菌，并对其进行生物学和抑菌性研究，为根瘤内生菌的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物病原菌：小麦纹枯病菌(R.cerealis)由西藏农牧学院生物技术中心真菌室提供。供试培养基参考李振高等[22]的方法配制。供试根瘤内生细菌：从米林县采集健康砂生槐的根瘤，分离获得编号R1～R45共45株根瘤内生细菌用于本研究。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦纹枯病菌拮抗内生细菌初筛

采用两点对峙法[23]。用灭菌打孔器制备直径为0.6 cm病原菌菌饼，使用无菌接种针挑起菌饼(有菌面朝下)放于 PDA培养基中央，把2种不同编号内生细菌均匀接种于距平板边缘约2.5 cm 处，置于28 ℃恒温培养箱倒置培养 5 d，以不接种内生细菌的病原菌菌落为对照(CK)；观察并测量培养基中小麦纹枯病菌菌落直径。按以下公式计算抑菌率。

抑菌率=(对照菌落直径-对峙培养病原菌菌落直径)/对照菌落直径×100%

1.2.2 小麦纹枯病菌拮抗内生细菌复筛

采用菌丝生长速率法[24]。把1.2.1中抑菌率较高的内生菌菌株接种到 NA 液体培养基中，28 ℃、130 r·min-1恒温振荡培养 7 d 后，12 000 r·min-1离心 10 min收集上清液，过 0.45 μm 滤膜，在无菌条件下，将除菌发酵滤液与冷却至55 ℃的 PDA 培养基按1∶9(v/v)混合均匀制成平板，以添加等量无菌水为对照，在平板中央接种生长旺盛的小麦纹枯病菌菌饼(直径为 0.6 cm)，28 ℃恒温培养 3～5 d，测量菌落直径，计算抑菌率。每个处理 3 次重复。

1.2.3 所筛选内生细菌除菌发酵滤液对小麦纹枯病菌的影响

选取大小一致的小麦纹枯病菌的菌核，在75%(v/v)乙醇溶液中处理5 min，无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干水分备用。取1.2.2中抑菌率较高菌株的除菌发酵滤液与PDA培养基按1∶9(v/v)混合均匀制成平板，每个平板接种25个菌核，重复3次，以添加等量无菌水为对照；培养3～7 d，观察菌核萌发情况。菌核萌发后继续培养15 d，观察菌核萌发后形成次生菌核的数量。

在显微镜(10×40)下观察所筛选菌的抑菌圈边缘小麦纹枯病菌菌丝生长情况，以正常生长的病原菌边缘菌丝为对照。拍照并记录结果。

1.2.4 所筛选内生细菌的拮抗谱测定

采用1.2.1方法测定1.2.2中筛选出的强拮抗菌株对番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)、马铃薯干腐病菌(Fusariumsulphureum)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、梨黑星病菌(Venturiapiritna)和小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)的抑菌效果。

1.2.5 菌株的固氮、溶磷及产IAA能力测定

固氮能力测定参考胡春锦等[25]的方法，溶磷及产IAA 能力测定参考姚玉玲等[26]的方法。

1.2.6 所选菌株的活体筛选

盆栽试验参照文才艺等[9]的方法进行。按下式计算病情指数和防治效果。

发病率= 发病株数/总株数 ×100%，

病情指数=[∑(各级病株数×各级严重度) /(调查总株数×最高级别严重度)]×100

防治效果=[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100%

1.2.7 所选菌株的生物学鉴定

形态、生理生化特征测定参考文献[22] 和[27]的方法。

拮抗菌株对碳源、氮源的利用参考李振高等[22]的方法进行。碳源利用：将不同碳源于112 ℃灭菌20 min后加入已灭菌的基础培养基中；用接种针蘸取菌悬液接入培养液中，置于30 ℃培养，观察记录生长情况。以葡萄糖为阳性对照，无碳培养基为阴性对照。氮源利用：将不同氮源于112 ℃灭菌20 min后加入已灭菌的基础培养基中；用接种针蘸取菌悬液接入培养液中，置于30 ℃培养，观察记录生长情况。以蛋白胨为阳性对照，无氮培养基为阴性对照。供试碳、氮源各15 种(见表4)，每个处理 3 次重复。

16S rDNA 基因扩增、序列测定与系统分析参考孙建光等[28]的方法进行，利用 EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)和 NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行基因序列比对，系统进化分析采用软件Mega(ver.5.1)进行。

2 结果和分析

2.1 内生拮抗菌株初筛

采用平板对峙培养法对45 株砂生槐根瘤内生细菌进行拮抗试验，初步筛选出了对小麦纹枯病有拮抗作用的内生细菌共4 株(表 1)，占分离菌株数量的8.89%。不同内生细菌对小麦纹枯病菌的抑菌率不同。4株菌的抑菌圈直径、菌落直径和抑菌率差异均显著；菌株R4的抑菌效果最好，抑菌率为57.11%，其次为菌株R11，抑菌率为45.44%，菌株R24和R25抑菌分别为32.33%和29.03%。

表1 对小麦纹枯病菌拮抗的砂生槐根瘤内生细菌Table 1 Antagonistic endophytic bacteria from Sandliving sophora nodules against Rhizotonia cerealis

同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Lower-case letters in same column indicate significant difference at 0.05 level. The same in tables 2-4.

2.2 砂生槐根瘤内生拮抗细菌复筛

由表 2 可知，4株砂生槐根瘤内生细菌除菌发酵滤液对小麦纹枯病菌抑菌率均达到62%以上，其中，抑制率最高为菌株R4，培养5 d时的抑菌率为98.2%；R25的抑菌率较低，其培养5 d时的抑菌率仅为62.9%。综合初筛和复筛结果，选择菌株R4开展后续研究。

2.3 菌株R4对小麦纹枯病菌菌核萌发的作用

菌株R4除菌发酵滤液对小麦纹枯病菌菌核萌发的试验结果(图1)显示，菌株R4除菌发酵滤液对小麦纹枯病菌菌核萌发有明显的抑制作用。7 d后菌株R4除菌发酵滤液处理的小麦纹枯病菌菌核形成菌丝的萌发率为8.0%，而CK的萌发率达到100%；但15 d后，菌株R4除菌发酵滤液处理的菌核全部萌发，说明菌株R4的除菌发酵滤液只是延迟小麦纹枯病菌菌核的萌发而不能杀灭菌核。可能是由于菌核的抗逆性很强的缘故，这一结论还需进一步进行验证。经观察，15 d后经菌株R4除菌发酵滤液处理的小麦纹枯病菌菌核萌发后形成次生菌核的数量较对照减少了93.8%。

2.4 菌株R4对小麦纹枯病菌菌丝的作用

观察可知，对照小麦纹枯病菌菌丝粗细均匀，颜色一致(图2A) 。菌株R4除菌发酵滤液处理后，小麦纹枯病菌菌丝变粗、节间缩短、小分枝增多，局部原生质浓缩，形成瘤状结。

表2 拮抗内生细菌代谢液对小麦纹枯病菌的抑菌率Table 2 Inhibitory ratio of endogenous bacterial metabolites on Rhizotonia cerealis %

A:对照；B:菌株R4发酵滤液处理。 A:CK; B:Treated with fermentation filtrate liquid of strain R4.

2.5 菌株R4的抗菌谱

平板对峙试验结果表明，菌株R4具有较广的抑菌谱。对供试的番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌、玉米大斑病菌、马铃薯干腐病菌、油菜菌核病菌、梨黑星病菌和小麦赤霉病菌7种病原真菌均有不同程度的抑制作用。菌株R4对以上7种病原真菌的抑菌圈半径分别为9、8、11、10、8、6和 9 mm。表明菌株R4对所测试的植物根部病原菌和叶斑病菌均具有良好的抑制作用。

2.6 菌株R4的固氮、溶磷及产IAA性

利用半微量凯氏定氮法测定菌株R4的固定氮量，采用溶磷圈和钼锑抗比色法测定其有效磷增量，采用 Salkowski 比色法测定菌株分泌植物生长激素(IAA)的功能。结果(表3)表明，菌株R4培养 10 d的固定氮量达到 44.0 mg·L-1，比 CK 增加了 14.06倍；有机磷有效含量为92.70mg·L-1,比CK增加了3.62倍；无机磷有效含量为15.47 mg·L-1，比 CK 增加了1.17倍；分泌 IAA 量为38.25 μg·L-1，比 CK 增加了14.48倍，差异均显著。

A:对照；B:菌株R4发酵滤液处理。 A:CK; B:Treated with fermentation filtrate liquid of strain R4.

A：小麦赤霉病菌， 菌株R4 处理；B：小麦赤霉病菌，CK； C:马铃薯干腐菌，菌株R4 处理；D：马铃薯干腐菌，CK。

2.7 菌株R4发酵液对小麦纹枯病的防治效果

盆栽试验表明，菌株R4发酵液和R4除菌发酵滤液处理小麦纹枯病植株的发病率和病情指数均显著降低。发酵液和除菌发酵滤液对小麦纹枯病的防治效果分别为73.82%和54.39%；发酵液防治效果显著优于除菌发酵滤液的，二者的发生率和病情指数显著优于对照。因此，菌株R4可作为小麦纹枯病的生防菌资源。

表3 培养基及菌株R4发酵液中的氮、磷、IAA含量Table 3 Content of N,P and IAA in culture medium and strain R4 fermentation liquid mg·L-1

表4 拮抗菌R4发酵液对小麦纹枯病的防治效果Table 4 Control effect of fermentation liquid of antagonistic endophytic bacterium strain R4 from Sandliving sophora nodule against Rhizotonia cerealis

2.8 菌株R4形态、生理特征和种类鉴定

菌株R4菌体呈短杆状，大小为1.0～1.2 μm ×3.0～4.0 μm，革兰氏阳性菌，能形成芽胞；形成芽胞时，菌体近端膨大，胞囊明显膨胀；芽胞椭圆形，位于胞囊一端(图 4A)。

在LB培养平板上，培养 5～7 d 形成直径为 1～10 mm 左右的菌落，不规则，单菌落平坦，乳白色，不透明，有光泽(图 4B)。

菌株R4对接触酶反应呈阳性，对氧化酶反应呈阴性，对吲哚反应呈阴性，甲基红试验(M-R试验)呈阴性，乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)呈阳性，硝酸盐还原呈阳性。能水解淀粉，利用葡萄糖和蔗糖时产酸、产气，可利用乳糖，能使明胶液化，使牛奶胨化，不产硫化氢，可利用柠檬酸盐。在0～2% NaCl 溶液中生长，最适生长温度为 30～32 ℃，4 ℃下生长缓慢，生长最适 pH 7～9。

菌株R4可以作为唯一碳源利用的有D-纤维二糖、D-海藻糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-半乳糖、松三糖、棉子糖、D-甘露糖、D-甘露醇；不能作为唯一碳源利用的有七叶苷、山梨糖、菊糖、L-阿拉伯糖、羧甲基纤维素钠。

菌株R4利用氮源的种类较多，对提供的15种氮源均能利用(表4)。

将 16S rDNA 序列与 GenBank 数据库中的序列进行 BLAST 比对，结果表明，菌株 R4 与类芽胞杆菌属(Paenibacillussp.)的同源性较高，将其与类芽胞杆菌属全部 11个种的菌株的序列进行遗传距离计算，用邻位相连法构建系统进化树(图 5)。从图 5 可知，菌株R4与类芽胞杆菌属(Paenibacillussp.)的菌株都划分在同一簇内，且与土地类芽胞杆菌PaenibacillusterraeAM141 菌株(登录号为AF391124)亲缘关系最为接近，相似性为99.2%。根据菌株R4的形态特征、生理生化特性及 16S rDNA 基因序列比对结果，参照《常见细菌系统鉴定手册》[27]，菌株R4被鉴定为土地类芽孢杆菌Paenibacillusterrae。

A:菌株R4的菌体显微形态; B:菌株R4 在LB培养基上生长的菌落形态。

表4 菌株R4对部分碳源、氮源的利用Table 4 Utilization of partly carbon sources and nitrogen sources by strain R4

图5 菌株R4的16S rDNA序列系统进化树

3 讨 论

利用植物内生细菌抑制植物病原微生物的生物防治国内外已开展许多研究，但从豆科植物特殊组织—根瘤中筛选病原菌拮抗菌株的研究较为少见[13]。根瘤内生细菌不仅将植物作为其栖息场所，而且对宿主植物有促生、防病、内生联合固氮等广泛的生物学作用。根瘤内生细菌相对于其他组织部位的内生细菌而言，对土壤的适应性更强，用于土传性病害的生物防治更具优势[11]。本研究从砂生槐根瘤内分离到45 株内生细菌，经初筛和复筛，发现菌株R4对小麦纹枯病菌具较强拮抗作用；平板试验中除菌发酵液的抑菌率为98.2%；盆栽试验中，菌株R4带菌发酵液和除菌发酵液对小麦纹枯病的防效分别为73.82%和54.39%，说明菌株R4活性代谢物质在其生防过程中发挥重要作用。带菌发酵液对小麦纹枯病的防治效果显著高于除菌发酵液，则说明菌株R4活性代谢物质在发挥生防作用的同时，菌体在小麦体内的定殖与其在盆栽土壤中持续发挥防治作用具有密切关系，本研究结果与文才艺等[9]试验结果类似。

土地类芽胞杆菌(P.terrae)是2003年在印度发现的新种，目前有土地类芽胞杆菌7个菌株被作为功能菌株进行报道[29]。主要为水藻收获絮凝剂菌株AM141、木聚糖酶产生菌HPL-003、产生N2O 的菌株 MH72、代谢木质素衍生的芳香族化合物的菌株以及于文清等[29]从大豆根周土壤分离到的具有固氮、溶磷、解钾、活化硅、抑制尖孢镰刀菌的菌株NK3-4。本研究筛选到的土地类芽胞杆菌R4具有固氮、溶磷、分泌IAA、抗菌谱广，对小麦纹枯病菌具有较好的防治效果等功能，在国内外未见报道，可为新生物制剂的研发提供新的微生物资源，为化肥、农药减量化施用的可行性研究提供理论支持。