液质联用法测定川芎茶调丸中阿魏酸等6种成分的含量

张红贵 ，陈洪岩 ，孙 晓 ，张小龙 ，，吴启南 *连云港市第一人民医院，连云港 00；连云港市食品药品检验检测中心，连云港 000；南京中医药大学，南京 00

川芎茶调丸具有疏风止痛之功效，可用于外感风邪所致头痛及恶寒、发热、鼻塞[1]等。其处方由川芎、白芷、羌活、细辛、防风、荆芥、薄荷、甘草8味中药组成。目前，《中国药典》2015年版第一部收载了川芎茶调丸的质量标准，其仅对制剂中的阿魏酸含量作了质控。所见文献报道的也是运用高效液相色谱法（HPLC）测定该药中的阿魏酸含量[2]，而其它成分欧前胡素、异欧前胡素、细辛脂素、升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷未测[3-7]，但对人体也有重要的药理作用。现有文献对上述6种成分的测定通常是用HPLC法。但是，运用HPLC-DAD法测定时需要达到基线分离，而此时各成分间往往难以完全分离，且耗时较长[8]。液相色谱联用质谱具有灵敏度高、选择性好，且可以在待测组分无需完全分离情况下同时测定等优点。本文运用液相串联三重四极杆质谱测定了川芎茶调丸中6种成分，为该制剂的生产和使用提供进一步的质量控制依据。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

LC-30高效液相色谱仪（包括SIL-30A型自动进样器、LC-30AD二元输液泵、真空脱气机、CTO-30A柱温箱），日本岛津公司；QTRAP 5500型三重四级杆质谱仪 （美国AB Sciex公司）；AG135型十万分之一电子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：阿魏酸（纯度99.0%）、欧前胡素（纯度99.7%）、异欧前胡素（纯度99.4%）、细辛脂素（纯度99.8%）、升麻素苷（纯度 96.2%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（纯度96.1%），均由中国食品药品检定研究院提供；川芎茶调丸 （批号20181104、20181012、20181025，江苏康缘药业）；甲醇、乙腈、乙醇（Germany，Merck）、甲酸（USA，Mreda Technology Incorporation）、甲酸铵（USA，Fisher Scientific）均为色谱纯；超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB C18（2.1 mm ×100 mm，2.7 μm）；流动相：以 0.1%甲酸乙腈-5 mmol·L-1甲酸铵溶液（40∶60）；柱温：35 ℃；流速：0.3mL·min-1；进样量：1μL。

2.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离源（ESI）；正负离子模式；采用多反应监测（MRM）模式；毛细管电压为5500V（正离子模式）、-4 500 V（负离子模式），脱溶剂温度为550℃，气帘气压力为241.3 kPa，雾化器与干燥气的压力均为379.2 kPa；离子源所用氮气纯度≥95%，碰撞气纯度≥99.999。6种待测组分的离子对质谱优化条件见表1。

表1 6种待测组分的离子对质谱优化条件

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素、细辛脂素、升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，用 90%甲醇-甲酸（20∶1）溶解，分别制成498.2、465.0、456.4、400.8、384.8、407.5 μg·mL-1的对照品贮备液；精密吸取上述对照品储备液各1 mL，置同一 100 mL 量瓶中，加 90%甲醇-甲酸（20∶1）稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液I。

精密量取混合对照品溶液Ⅰ2.5 mL，置100 mL量瓶中，加 90%甲醇-甲酸（20∶1）稀释至刻度，摇匀，制成每毫升分别含上述成分 124.6、116.2、114.1、100.2、96.20、101.9ng的混合对照品溶液Ⅱ。

2.4 供试品溶液的制备

取本品，研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入 90%甲醇-甲酸（20∶1）10 mL，密塞，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用90%甲醇-甲酸（20∶1）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。精密量取续滤液2mL，置100mL量瓶中，加 90%甲醇-甲酸（20∶1）稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5 阴性对照试验

按照川芎茶调丸处方[1]，制成缺川芎、白芷、羌活、细辛、防风的阴性对照样品，按“2.4”项下方法制得阴性对照溶液。精密量取对照品、供试品、阴性对照溶液各1μL，进行测定，色谱图见图1。

图1 对照品溶液及供试品溶液色谱图 （A）提取离子流色谱图；（B）叠加色谱图

2.6 线性关系考察

精密吸取“2.3”混合对照品溶液Ⅰ适量，用90%甲醇-甲酸（20∶1）稀释，配制成阿魏酸浓度为 1 246、622.8、311.4、124.6、62.28、31.14 ng·mL-1， 欧前胡素浓度 1162、581.2、290.6、116.2、58.12、29.06ng·mL-1，异欧前胡素浓度为1141、570.5、285.2、114.1、57.05、28.52 ng·mL-1，细辛脂素浓度为 1 002、501.0、250.5、100.2、50.10、25.05 ng·mL-1，升麻素苷浓度为 962.0、481.0、240.5、96.20、48.10、24.05 ng·mL-1，5-O-甲基维 斯 阿 米 醇 苷 为 1019、509.4、254.7、101.9、50.94、25.47 ng·mL-1，进样，依法测定其峰面积。以对照品浓度（ng·mL-1）为横坐标，各对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程，结果见表2。

2.7 进样精密度试验

精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液Ⅱ1 μL，按“2.1”及“2.2”项下条件连续进样6次，记录峰面积。结果阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素、细辛脂素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD分别为 1.22%、1.00%、1.24%、2.60%、2.29%、1.73%。

表2 回归方程与线性范围

2.8 溶液稳定性试验

吸取“2.4”项下供试品溶液（批号20181104）适量， 分别在室温下放置 0、4、8、12、16、20、24 h，进样，结果阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素、细辛脂素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD分别为 1.48%、1.21%、1.88%、2.32%、2.12%、1.97%。表明在供试液中待测组分在室温24h内稳定。

2.9 重复性试验

精密称取同一样品（批号20181104）6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样，结果阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素、细辛脂素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷平均含量分别为 177.9、70.44、213.6、40.20、138.2、96.00μg·g-1，RSD分别 2.08%、1.92%、1.49%、2.14%、2.83%、2.76%。

2.10 加样回收率试验

取同一样品（批号20181104）6份，每份约0.25g，精密称定，分别精密加入各对照品储备液适量，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”及“2.2”项下条件进样，计算得阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素、细辛脂素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷6种成分的平均回收率 （%）及RSD （%），分别为98.50、1.42，104.14、3.73，102.84、0.77，96.38、2.94，99.63、1.71，98.33、2.55（n=6）。

2.11 样品含量测定

取3批川芎茶调丸样品各适量，按“2.4”项下方法分别处理，再按“2.1”及“2.2”项下条件进样，计算样品含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n=6）

3 讨 论

本文考察了3种流动相。通过实验发现，以乙腈-5 mmol·L-1甲酸铵溶液为流动相时，阿魏酸、细辛脂素均不出[M+H]+峰，其它待测组分峰响应较高。以乙腈-0.1%甲酸为流动相时，阿魏酸、细辛脂素均出[M+H]+峰，但响应较低，欧前胡素、异欧前胡素响应降低一半左右。以0.1%甲酸乙腈-5mmol·L-1甲酸铵溶液为流动相时，阿魏酸、细辛脂素的[M+H]+峰响应依然较低，欧前胡素、异欧前胡素响应提高。考虑质谱优化，最终选择以0.1%甲酸乙腈-5mmol·L-1甲酸铵溶液为流动相。另外，0.1%甲酸乙腈-5mmol·L-1甲酸铵溶液的比例在40∶60时，6个待测组分能够基本分开，尤其是欧前胡素与其同分异构体异欧前胡素能够完全分开。

由于阿魏酸的[M+H]+峰在上述3种流动相中响应均不是很高，且有阿魏酸在负离子模式下测定的文献报道[9]，本文采用负离子模式测定阿魏酸。通过实验可知，阿魏酸的[M-H]-峰响应较高，故对阿魏酸采用负离子模式测定。对于细辛脂素，未采用负离子模式测定，因为在质谱条件优化时，其在负离子模式下，碎片离子峰响应很低。通过查阅文献[10]及实验得知，其[M+NH4]+峰响应较高，故最终在正离子模式下测定细辛脂素的[M+NH4]+峰。

考察了甲醇、乙醇、90%甲醇-甲酸（20∶1）作为提取溶剂，分别用超声、回流、浸泡过夜法提取样品，结果表明，以 90%甲醇-甲酸（20∶1）为溶剂，超声提取45min效果良好，可将待测组分提取完全。