茶油清润合剂治疗小鼠便秘疗效观察及作用机制研究※

刘海华 郑保平 林唐唐 唐 杨 黄东北 邱传珍 谢 云 叶艳清

（赣南医学院第一附属医院中医科，江西 赣州 341000）

便秘是消化系统常见疾病，主要表现为每周排便次数少于3次和（或）粪便干结、排便费力、排出困难、排便不尽感、排便费时、需手法辅助排便［1-2］。我国成年人慢性便秘患病率为4%～6%，60岁以上人群高达22%［3］，且发病率呈上升趋势。课题组常用中医药对该病干预治疗，以“清、润、通”立法，拟茶油清润合剂治疗，临床疗效确切，本研究旨在通过动物实验研究探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁昆明小鼠72只，雌雄各半，体重（20±2）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002。分笼饲养，每笼3只，湿度30%～50%，温度20～26℃，自然光线，自由摄食饮水适应性喂养3天。

1.2 药物 茶油清润合剂由茶油、生地黄、玄参、麦冬、生黄芪、生白术、厚朴、枳壳、隔山消制成，由赣南医学院第一附属医院中药房提供。麻仁丸，批号：170403，由南京同仁堂有限公司提供。洛哌丁胺，批号：161028325，由西安杨森制药有限公司提供。

1.3 主要试剂及仪器 一抗：SP抗体，北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0065R。VIP抗体，北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0077R。NOS-1抗体，北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-10197R。二抗：ChemMate TM DAKO Envision TM Detection Kit，DAKO货号：GK500705。显微镜，Olympus，型号：CX41。拍照系统，广州市明美科技有限公司，型号：MC30。切片机，金华市益迪医疗设备厂，型号：YD-1508RⅢ。尺子，Deli，型号：8214。

1.4 造模方法 综合文献［4-5］，小鼠以大米喂养，禁水不禁食，加予洛哌丁胺灌胃，连续3 d。

1.5 分组与给药 将72只实验小鼠按性别随机分为空白对照组、模型组、茶油清润合剂低中高剂量组、麻仁丸组共6组，每组12只，雌雄各半；自由摄饲料饮水适应性喂养3天后，除正常对照组自由摄饲料饮水外，其余5组均喂养大米，禁水不禁食，予洛哌丁胺（9.38 mg/Kg），1次/日，灌胃3 d，3 d后，小鼠粪便数量明显变少，颗粒变小且质地硬；造模成功后，均饲料喂养，除空白对照组外，模型组予以0.9%生理盐水，茶油清润合剂低、中、高剂量组分别予以低（10.42 g/Kg）、中（20.84 g/Kg）、高（41.68 g/Kg）剂量茶油清润合剂，麻仁丸组予以麻仁丸（丸用水溶化，0.3 g/Kg），每天1次，连续灌胃3 d；3 d后，各组均禁食不禁水24 h后，空白对照组及模型组予以0.9%生理盐水+5%碳末混悬液灌胃，茶油清润合剂低、中、高剂量组分别予以低、中、高剂量茶油清润合剂+5%碳末混悬液灌胃，麻仁丸组予以麻仁丸（用水溶化）+5%碳末混悬液灌胃，每只小鼠灌胃30 min后处死并立即取肠组织，测量小鼠肠内碳末推进率，检测大肠P物质（SP）、血管活性肠肽（VIP）、一氧化氮氧合酶（NOS-1）表达并制片观察其组织病理变化。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 小鼠肠内碳末推进率测定 用颈椎脱臼法处死小鼠后，立即剖腹，取幽门到直肠末段的全部肠道，在松驰状态下测量肠道的全长及活性碳混悬液在肠道内推进的长度，并计算活性碳混悬液在肠道内推进的长度与肠道的全长的百分比。

1.6.1 结肠免疫组化染色及SP、VIP、NOS-1积分荧光密度值测定 取相同部位结肠，用生理盐水冲洗干净，放入10%的中性福尔马林液中固定，常规石蜡包埋，切片，用于免疫组化染色：二甲苯脱蜡2次，每次10 min；依次经100%，95%，85%，75%，50%乙醇和纯水各1次，每次5 min；PBS洗5 min；3% 过氧化氢室温湿盒孵育10 min；PBS洗5 min，3次；于微波炉中中高火加热至沸腾，低火维持沸腾继续加热8 min（柠檬酸抗原修复液），待水温自然降至室温；PBS洗5 min；10%正常山羊血清室温湿盒封闭30 min；一抗4℃孵育过夜；PBS洗5 min，3次；二抗室温湿盒30 min；PBS洗5 min，3次；DAB显色；PBS洗5 min，3次；苏木素复染；水洗去多余染液，分化数秒；水洗，返蓝；50%，75%，85%，95%和100%乙醇脱水，二甲苯透明2次，每次10 min；中性树胶封片。

每张切片随机抽取6个无重叠、无比邻视野，在同一额定光强、灰度级条件测量200倍物镜下，分析每一个视野的阳性所在位置，圈出，利用图像分析软件系统统计阳性蛋白表达所在范围的面积Area和积分荧光强度值（Integral Optic Density，IOD），然后利用IOD除以Area，即单位面积下的光密度值，最后求平均值；阳性细胞表达越多，IOD测值越大。

1.6.3 结肠组织病理学观察 将小鼠处死后，测完肠内碳末推进率后，取相同部位结肠组织，用甲酸溶液固定，石腊包埋切片，HE染色，光镜观察。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，实验数据以（）表示，组间比较采用独立样本t检验进行分析，检验水准α=0.05。

2 结果

实验结束后，模型组死亡2只，高剂量组死亡3只，麻仁丸组死亡1只，最终纳入统计动物数为66只。

2.1 各组小鼠肠内碳末推进率比较 与空白对照组比较，模型组降低且差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，茶油清润合剂低中高剂量组及麻仁丸组均升高且差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 各组肠内碳末推进率比较 （，%）

表1 各组肠内碳末推进率比较 （，%）

注：与模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 鼠数空白对照组模型组茶油清润合剂低剂量组茶油清润合剂中剂量组茶油清润合剂高剂量组麻仁丸组肠内碳末推进率74.45±13.49**53.97±9.75 68.88±17.24*70.68±11.71**73.42±14.87**61.63±4.62*12 10 12 12 9 11

2.2 各组小鼠大肠SP、VIP、NOS-1积分荧光密度值比较 与空白对照组比较，模型组SP降低、VIP升高、NOS-1升高且差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与模型组比较，茶油清润合剂低中高剂量组SP均升高且差异均有统计学意义（P＜0.01），VIP均降低且差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），NOS-1均降低但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠大肠SP、VIP、NOS-1积光强度值比较 （）

表2 各组小鼠大肠SP、VIP、NOS-1积光强度值比较 （）

注：与模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 鼠数空白对照组模型组茶油清润合剂低剂量组茶油清润合剂中剂量组茶油清润合剂高剂量组麻仁丸组NOS-1 0.097±0.029*0.136±0.130 0.129±0.064 0.125±0.066 0.116±0.055 0.129±0.066 12 10 12 12 9 11 SP 0.103±0.039**0.084±0.026 0.122±0.056**0.136±0.138**0.124±0.058**0.125±0.093**VIP 0.097±0.063**0.143±0.049 0.123±0.052*0.123±0.049*0.115±0.043**0.124±0.090

2.3 各组小鼠结肠病理组织学观察 空白对照组：粘膜无水肿、糜烂，腺体排列规整、结构清晰；粘膜下层亦无充血水肿；粘膜及粘膜下层无炎性细胞浸润。见图1。模型组：粘膜局部水肿、糜烂，腺体欠规整；粘膜下层局部充血水肿；粘膜及粘膜下层有大量炎性细胞浸润（淋巴细胞为主，少量巨噬细胞）。见图2。低剂量组：粘膜无明显水肿，略有糜烂，腺体稍欠规整；粘膜下层无明显充血水肿；粘膜及粘膜下层有较多炎性细胞浸润。见图3。中剂量组：粘膜无明显水肿、糜烂，腺体较规整；粘膜下层无明显充血水肿；粘膜及粘膜下层有少量炎性细胞浸润。见图4。高剂量组：粘膜无明显水肿、糜烂，腺体规整；粘膜下层无明显充血水肿；粘膜及粘膜下层稍有炎性细胞浸润。见图5。麻仁丸组：粘膜有水肿、糜烂，腺体稍欠规整；粘膜下层有充血水肿；粘膜及粘膜下层有少量炎性细胞浸润。见图6。

图1 空白对照组（HE x 200）

图2 模型组（HE x 200）

图3 低剂量组（HE x 200）

图4 中剂量组（HE x 200）

图5 高剂量组（HE x 200）

图6 麻仁丸组（HE x 200）

3 讨论

便秘为大肠传导失司，糟粕积滞于内，阻滞气机而致气滞，气滞则腑气不通，日久可壅而化热，热邪又可耗气伤津且壅塞气机，多呈“以虚为主，虚实夹杂”之机，既有“气血津液不足”之虚，又有“气滞、燥热”之实。茶油清润合剂由茶油、生地黄、玄参、麦冬、生黄芪、生白术、厚朴、枳壳、隔山消八味中药组成。茶油为中国南方亚热带湿润气候地区天然无污染的高山及丘陵地带特有的一种优质食用油料植物籽，《本草纲目》中记载“茶油性偏凉，凉血止血，清热解毒。主治肝血亏损，驱虫，益肠胃，明目”，方中选用茶油为君药，取其清热生津、养阴润燥之用。玄参苦咸而凉，滋阴润燥，壮水制火，启肾水以滋肠燥，生地甘苦而寒，清热养阴，壮水生津，麦冬甘寒，滋养肺胃阴津以润肠燥，三药合用为增液汤之意，共为臣药以加强茶油清热生津、养阴润燥之效。生黄芪、生白术皆能健脾益气，两药合用为佐药以补气，气足则排便有力，厚朴、枳壳、隔山消皆能顺气宽肠而合为佐药，气顺则排便通畅。本方咸寒苦甘同用，共奏清热生津、润肠通便之功，临床实践证明其对津枯肠燥型便秘具有很好治疗作用。

本研究显示：模型组小鼠肠内碳末推进率比空白对照组降低且差异有统计学意义（P＜0.01），说明便秘模型制作成功，茶油清润合剂低中高剂量组与模型组比较均升高且差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），说明低中高剂量茶油清润合剂均有治疗便秘作用。同时，茶油清润合剂低中高剂量组结肠病理变化较模型组均有改善，均可在一定程度上减少粘膜和粘膜下层局部水肿糜烂程度或炎性细胞数量，保持腺体规整，从而维护肠道排便功能。

SP是一种兴奋性神经肽，可使胃肠道平滑肌收缩以刺激胃肠道运动。国内外大量学者认为便秘发生与SP含量降低很可能有关，如：国外学者Tzavella K等［6］发现传输性便秘患者大肠粘膜、粘膜下层的SP含量低于正常；国内学者陈兰等［7］研究亦显示传输性便秘患者结肠肌间神经丛SP含量明显降低。运用茶油清润合剂治疗后，低中高剂量组肠内SP与模型组比较均升高且差异有统计学意义（P＜0.01），说明茶油清润合剂可增加肠内SP表达以刺激肠蠕动而促进排便。

VIP是一种非胆碱能非肾上腺素能神经介质，其神经元可以从功能上分为运动神经元和分泌神经元，VIP运动神经元主要是抑制胃肠肌紧张性以抑制胃肠运动，而VIP分泌神经元主要是刺激胰液和肠液分泌［8］。有研究显示便秘时结肠VIP含量较高，可抑制肠道平滑肌收缩和肠肌紧张性，减少肠粘膜的分泌活动，结肠运动减慢，从而引起便秘［9］。运用茶油清润合剂治疗后，低、中、高剂量组VIP与模型组比较均降低且差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），说明茶油清润合剂可减少肠内VIP表达以减轻对肠道的抑制从而促进排便。但也有文献报道传输性便秘肠壁内VIP含量降低，认为可能是因为结肠VIP神经元及神经纤维减少或缺失，可导致抑制反射减弱或消失，使结肠出现过度节段性蠕动，使这些肠道产生无效推动，甚至痉挛［10］。因此结合本次实验研究，VIP导致便秘的机制还需要进一步深入研究和证实。

NOS-1亦是胃肠道非胆碱能非肾上腺素能神经介质，主要是抑制胃肠蠕动，其机理可能是通过调节平滑肌内cGMP浓度引起平滑肌舒张，从而导致结肠运动减弱［11］。运用茶油清润合剂治疗后，低、中、高剂量组NOS-1与模型组比较虽均降低但差异无统计学意义（P＞0.05），说明茶油清润合剂并未通过改变肠内NOS-1表达以促进肠蠕动。

茶油清润合剂治疗便秘疗效确切，其作用机制可能是通过增加肠内SP表达以刺激肠蠕动，减少肠内VIP表达以减轻其对肠蠕动的抑制，减少粘膜和粘膜下层局部水肿糜烂程度或炎性细胞数量且保持腺体规整以维护肠道排便功能。