尿液防腐剂甲苯对24 小时尿葡萄糖检测的影响

张慧婵，雷 达，曹东林

24 h 尿液生化检测是反映肾脏功能的生化指标，尿糖的检测不仅反映糖尿病的代谢情况，也可检测和评价糖尿病的治疗效果，当血糖浓度超过8.88 mmol/L，即肾糖阈时，尿液中便可检测出葡萄糖。标本的正确留取和保存是获得准确检测结果的前提，临床留取24 h尿时，通常包括物理方法（冷藏法）和化学方法（防腐剂法），临床常用的尿液防腐剂有甲苯、甲醛、浓盐酸、氟化钠、冰乙酸和碳酸钠等，不同的尿液防腐剂有不同的防腐原理[1]。临床上首选防腐剂为甲苯，1 ml 尿液中加入甲苯5 μl[2]。甲苯防腐的原理是当甲苯足量时可在尿液表面形成一层薄膜，阻止尿液与空气接触、防止细菌生长、稳定代谢产物等，达到防腐效果，常用于尿糖、尿蛋白、化学成分的定性或定量检测[3]。由于24 h 尿液的留取与储存受较多因素的影响，如容器、放置环境和测量方式；且尿防腐剂法在实际应用中有着不可忽视的弊端，临床对于留取24 h 尿液是否需要加入防腐剂存在较大争议，目前只有关于尿蛋白定量和尿液钙、镁等离子测量中加入甲苯防腐必要性的研究探讨，以及不同防腐剂防腐效果的比较研究[3-5]。暂无关于24 h 尿液留取用于尿糖的检测时是否需要防腐的相关研究报道。本研究留取了相关尿液标本，用甲苯作为防腐剂，分别在0 h、12 h 和24 h 三个时间点对尿糖进行定量分析以探究留取24 h 尿时加入甲苯防腐剂的必要性，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 留取广东省第二人民医院临床检验室用于尿常规检测的住院患者晨尿标本40 例，其中按尿糖定性结果分为“-”、“+”、“++”、“+++”各10 例。微生物室Bio Mérieux 血平板培养基40 个。收集标准为自然排尿法，无经血、白带、精液、粪便等混入。

1.2 仪器与试剂 希森美康（Sysmex）UF-1000i 自动尿沉渣分析仪及该仪器的配套试剂和质控品；恒温细菌培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；日立7600全自动生化分析仪及迈克生物股份有限公司尿糖检测试剂盒，所有尿液检测用同一台仪器，同一批号试剂。

1.3 方法

1.3.1 尿量与甲苯最适配比 按需要将不同尿量置于3 个无菌尿管中，往液面中缓慢滴加甲苯，观察液面，在液面刚好形成膜时所需要的甲苯用量，甲苯和尿液按标准比例配比的用量分别绘制趋势线，两条趋势线的相交点表示当甲苯和尿液的比例合适时，刚好能在液面形成保护层，即为最适尿液与甲苯用量，见图1。

图1 尿量与甲苯的配比

1.3.2 尿液葡萄糖定量 留取临检室尿常规Sysmex UF-1000i 自动尿沉渣分析仪葡萄糖定性结果阴性和阳性的住院晨尿标本40 例，每个标本留取10 ml，其中尿糖阴性10 例，尿糖阳性30 例，且阳性程度呈一定梯度增加。收集标本即刻检测尿糖浓度（0 h 尿糖浓度），并接种血平板做细菌计数培养。将标本混匀并平均分成2份，每份5 ml，置于无菌尿管中，一份加入甲苯25 μl（甲苯组），一份不加甲苯（无甲苯组），作为自身对照，4 ℃冰箱保存，分别放置12 h 和24 h 后取0.5～1 ml于反应杯中，在日立7600 全自动生化分析仪上检测尿糖浓度，全部标本于12 h、24 h 两个时间点进行检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t 检验，不同时间点尿糖测量值的分析采用重复测量方差分析，方差协方差矩阵是否满足H 型条件的假设检验采用Mauchly 球形检验，校正系数用G-G；计数资料采用频数表示，组间比较采用Pearson χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 同一保存条件不同放置时间尿糖定量结果的比较重复测量方差分析结果显示方差协方差矩阵不满足H型条件（χ2=10.034，P＞0.05，G-Gε=0.891）；无论是否加入甲苯防腐均直接4 ℃冰箱保存，放置不同时间后对尿糖定量结果的影响均无统计学差异（P＞0.05，表1）。

表1 同一保存条件处理后放置不同时间尿糖浓度的情况比较

表1 同一保存条件处理后放置不同时间尿糖浓度的情况比较

保存条件 例数 时间点0 h 12 h 24 h有甲苯 40 10.28±12.15 10.26±12.17 10.28±12.10无甲苯 40 10.29±12.16 10.25±12.15 10.35±12.29

2.2 同一时间点不同保存条件尿糖定量结果的比较比较同一时间点两组（无甲苯组，甲苯组）尿糖差异，处理（加入甲苯）后即刻（0 h）；放置12 h 与24 h 三个时间点两组结果的比较均无统计学差异（P＞0.05，表 2）。

表2 同一时间点不同保存条件之间的两两比较

检测时间 尿糖浓度 t 值 P 值有甲苯 无甲苯0 h 10.28±12.15 10.29±12.16 -1.215 0.232 12 h 10.26±12.17 10.25±12.15 0.674 0.505 24 h 10.28±12.10 10.35±12.29 -1.277 0.209

2.3 菌落计数结果 尿液标本培养24 h 后的菌落计数结果显示两个变量(尿糖定性结果和尿液菌落数量)之间没有显著性相关（P＞0.05，表3）。尿液中原有细菌的多少与尿糖浓度没有相关性。

表3 尿液细菌培养24 h 后菌落计数结果（个/μl）

3 讨 论

葡萄糖为机体提供营养和能量，是机体运转不可或缺的物质之一，正常机体血糖浓度为空腹血糖≤6.1 mmol/L，用餐2 h 后的血糖≤7.8 mmol/L，尿糖干化学定性为“-”。如果血液中葡萄糖含量超出了肾糖阈，尿液中就会出现葡萄糖。慢性糖尿病患者需长期监测血糖浓度，虽然目前有静脉留置针技术的辅助，避免了重复静脉抽血给患者带来的痛苦[6]，但是相比之下，对尿糖进行检测比直接测量血糖操作简单方便、经济效益高。文献[7]研究发现尿糖的升高与血糖的升高呈正相关，所以可通过监测尿糖的浓度来初步反映血糖水平。尿糖干化学法定性的简便易行还可用于对健康人群血糖水平的筛查。尿液干化学法定性的结果受到尿液酸碱度和尿液本身所含的氧化物质的影响。如过高的维生素C 会对尿糖定性造成假阴性结果[8]，尿液生化检测以其操作简单，葡萄糖定量指标水平检测准确率高等优点得到广泛应用[9]，为了更准确的反映葡萄糖的浓度水平，可进行尿糖定量检测。临床上随机时间点对某项指标的检测受到的影响因素较多，为了更准确的反映24 h 内机体某项指标的排泄量，需要留取24 h 尿液。检测前步骤的严格把控是获得正确结果的前提，尿液标本的正确留取和保存是检测前质量控制的关键步骤[10]。甲苯的刺激味道有些患者很难接受，并且使用防腐剂收集尿液过程复杂，也会对操作者有一定程度的危害。Miler 等[11]调查显示出门诊患者对于24 h 尿液的正确收集依从性很低，错误的容器，错误的采样时间和错误的测量方式都是分析前质量低的原因，对于有着刺激性气味及潜在毒性的甲苯防腐剂的应用更难以接受。尿液防腐剂甲苯的用量有严格的规定，考虑到门诊患者无法正确把握用量，且已有相关报道称甲苯具有神经毒性，对中枢神经系统有麻醉作用，长期的吸入可引起急性中毒性脑病、脑水肿、出现不同程度的意识及精神障碍，引起不同程度的肝、肾、肺等器官损伤，严重者常因多器官功能衰竭而死亡[12]。本研究对24 h 尿液的留取是否有必要使用毒性防腐剂进行了探讨。

由于24 h 尿液留取的不方便，临床上常使用随机尿样验证防腐剂的影响[13]。本研究采用住院晨尿代替24 h 尿液，为使结果更准确，且对相当范围的尿糖结果有说服力，实验留取的标本对尿糖定性结果进行了人为选择——包括“-”、“+”、“++”、 “+++”各10 例。由于随机尿标本留取过程受污染是无法避免的，已有相关文献做过比较实验证明4 ℃冰箱保存可达到跟甲苯防腐一样的抑菌效果，在两组实验中证明24 h 后菌落的数量与一开始无统计学差异，而室温保存组细菌大量繁殖[14]。本研究只对每一个尿标本收集即刻进行菌落计数。结果显示无论是低浓度还是高浓度尿糖，加入防腐剂与放置4 ℃冰箱保存12 h、24 h后的尿糖结果均无统计学差异，与即刻尿糖定量结果比较也无差异；尿液细菌的菌落数量与尿糖定性结果的高低不相关，不同菌落数的尿液在两个条件下保存12 h 和24 h 后尿糖定量结果也无统计学差异。说明在24 h 尿液的保存中加入甲苯防腐并不是必要的。

本研究在操作过程中发现，当尿液标本上机检测时混有甲苯防腐剂，会干扰试验过程，对尿糖定量结果有影响。试验操作过程发现部分样本甲苯组的定量结果很不稳定，吸样重复测量也是如此，在排除了机器原因和试剂原因后，将标本离心再严格吸取下层样本上机检测时结果稳定，这一现象说明标本中混入甲苯会干扰测量结果。国内也有相关研究报道当24 h 尿用强生干化学法检测尿蛋白时，甲苯的加入与干化学法尿蛋白检测试剂盒的说明书相悖——说明书上明确标注不可使用防腐剂[15-17]。24 h 尿液留取后通常用于检测多个指标，其中也包括尿蛋白，额外物质的混入很难保证不对试验结果造成影响，而通过本研究可以得出24 h 尿液的保存可以不加入防腐剂4 ℃冰箱保存，避免了因防腐剂的混入而影响定量结果的问题。

总之，本研究发现24 h 尿液留取（用于葡萄糖定量检测）过程，加盖4 ℃冰箱保存可达到与加入甲苯防腐剂一样的“防腐”效果，在4 ℃冰箱保存24 h 后尿糖的定量结果和加入甲苯防腐剂保存24 h 后的测定值、即刻测定值之间比较均无统计学差异，因此临床留取24 h 尿液可以不加入防腐剂。