龟鹿二仙口服液质量标准研究△

史兆松，马栋栋，张淹，李士栋，周祥山

1.东阿阿胶股份有限公司/国家胶类中药工程技术研究中心/山东省胶类中药研究与开发重点实验室，山东 聊城 252201； 2.华润昂德生物药业有限公司，山东 聊城 252201

龟鹿二仙口服液由龟甲、鹿角、党参、枸杞子4味中药材组成。具有温肾益精的功效，临床上主要用于久病肾虚，腰酸膝软和遗精阳痿等。该产品质量标准中缺少鉴别和含量测定方法，为更好地控制产品质量，保证临床用药安全有效，对质量标准开展再提升研究。分别对龟甲、鹿角、党参、枸杞子四味中药材进行薄层色谱鉴别，对甜菜碱进行含量测定，为产品的质量控制提供数据参考。

1 材料

1.1 仪器

Ultimate3000型高效液相色谱仪(Dionex)，UltiMate3000系列光电二极管阵列检测器，色谱柱为丙基酰胺键合硅胶为填充剂(150 mm×4.6 mm，5 μm)；BS224S型电子天平(赛多利斯)；C9960A型超声清洗仪(CBL Photoelectron Technology)；薄层摄像仪(瑞士CAMAG公司)；Mili-Qpius型超纯水制备仪(密理博公司)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)。

1.2 试药

甘氨酸、甜菜碱、党参对照药材、枸杞子对照药材(中国食品药品检定研究院，批号分别为：110735-200102、110894-200503、121057-201206、121072-201109)；各阴性对照样品均为自制；乙腈、甲醇均为色谱纯；水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

龟鹿二仙口服液产自东阿阿胶股份有限公司，批号分别为：20140601、20140602、20140603、20140801、20150101、20150102、20150103、20150401、20150402、20150403。

2 薄层色谱鉴别

2.1 甘氨酸鉴别

取本品1 mL，置具塞试管中，加水2 mL，盐酸2 mL，密塞，置105 ℃干燥箱中加热6 h，取出，加水6 mL摇匀，滤液蒸干，残渣加10%乙醇10 mL使溶解，作为供试品溶液；取缺龟甲、鹿角的阴性样品同法制成阴性样品溶液。另取甘氨酸对照品，加10%乙醇溶解，制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液及阴性对照溶液各2 μL、对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂：苯酚-0.5%硼砂水溶液(4∶1)，展开，取出，晾干，置105 ℃干燥箱中加热10 min，取出，立即喷以2%茚三酮乙醇溶液，至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照色谱中无相应斑点，见图1。

注：1.甘氨酸；2～4.样品；5.阴性样品。图1 甘氨酸薄层色谱图

2.2 党参鉴别

取本品60 mL，加水饱和的正丁醇振摇提取3次(40、40、30 mL)，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次20 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺党参的阴性样品同法制成阴性样品溶液。另取党参对照药材4 g，分别加水30 mL煎煮两次，每次30 min，合并煎液，滤过，滤液同法制成党参对照药材溶液。吸取上述3种溶液各20 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15∶2∶2)，展开，取出，晾干，喷以硫酸-乙醇(1∶1)，置105 ℃干燥箱中加热约7 min，置紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照色谱中无相应斑点，见图2。

注：1.党参对照药材；2～4.样品；5.阴性样品。图2 党参薄层色谱图

2.3 枸杞子鉴别

取2.2项下制备的供试品溶液。取缺枸杞子的阴性样品和枸杞子对照药材2 g，同2.2项方法制成阴性样品和对照药材溶液。点样、展开、显色等操作同2.2项下方法。结果见图3。

注：1.枸杞子对照药材；2～4.样品；5.阴性样品。图3 枸杞子薄层色谱图

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验

采用HILIC(丙基酰胺键合硅胶)色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(80∶20)为流动相；柱温为30 ℃；蒸发光散射检测器检测漂移管温度为98 ℃；体积流速为0.8 mL·min-1。

3.2 甜菜碱对照品溶液

精密称取甜菜碱，加水溶解制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

3.3 供试品溶液制备

精密吸取本品20 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇40 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率：800 W，频率：40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，先上预处理的阴离子树脂柱(内径为1.5 cm，柱高为15 cm)，用40 mL水洗脱，收集洗脱液，后上预处理的阳离子树脂柱(内径为1.5 cm，柱高为15 cm)，用40 mL水洗脱至无色，弃去洗脱液，再用15%氨水溶液40 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量水溶解，转移至10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性样品溶液制备

精密吸取缺枸杞子的阴性样品20 mL，同3.3项方法制成。

3.5 专属性试验

分别精密吸取上述3种溶液各5 μL，按照3.1项下色谱条件进行测定。结果表明，阴性对照无干扰，见图4。理论板数按甜菜碱峰计算应不低于4000。

3.6 检测限及定量限

将甜菜碱对照品色谱峰测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，分别以信噪比为3∶1及10∶1时注入液相色谱仪的量确定检测限与定量限，检测限为0.68 ng，定量限为2.40 ng。

3.7 线性关系考察

精密称取甜菜碱4.12 mg，置10 mL量瓶中，加水溶液至刻度，摇匀。分别吸取2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，按照3.1色谱条件依次进样，测定峰面积。以对照品的浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，得回归方程：Y=30.828X+23.654，r=0.999 9。甜菜碱在1.03～6.18 μg呈良好线性关系。

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性对照样品。图4 甜菜碱HPLC图

3.8 精密度试验

取3.2项下对照品溶液，重复进样6次，每次10 μL，按照3.1色谱条件测定峰面积，计算RSD为1.47%(n=6)，结果表明仪器精密度良好。

3.9 稳定性试验

精密量取本品(批号：20140801)20 mL，按照3.3项方法制备，分别于0、2、4、8、12、24 h进样6次，每次进样5 μL，测得峰面积，计算RSD为2.38%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.10 重复性试验

精密量取本品(批号：20140801)6份，按照3.3项方法平行制备，按照3.1项色谱条件，分别进样5 μL测定，甜菜碱平均含量为0.226 mg·mL-1，RSD为1.07%(n=6)，结果表明重复性良好，方法可行。

3.11 加样回收率试验

精密量取质量浓度为0.225 5 mg·mL-1的甜菜碱样品(批号：20140801)共6份，每份10 mL，分别精密加入甜菜碱对照品溶液(质量浓度为0.488 mg·mL-1)各6 mL，再加水至20 mL，制备6份供试品溶液，按照3.1项色谱条件，分别进样5 μL测定，计算回收率及RSD，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

3.12 耐用性试验

取本品按照3.1项下方法试验，因甜菜碱为水溶性生物碱成分，很难在C18柱上有所保留，并且无特异的紫外吸收，故确定选用HILIC色谱柱按照3.1项下的色谱条件对其进行测定，含量测定结果无明显差别。

3.13 样品测定

精密量取10批龟鹿二仙口服液样品(批号分别为：20140601、20140602、20140603、20140801、20150101、20150102、20150103、20150401、20150402、20150403)，按照3.3项下方法制备供试品溶液，按照3.1项色谱条件，分别进样5 μL测定，结果见表2。

表2 样品测定结果(n=10)

4 讨论

龟鹿二仙口服液是由龟甲、鹿角、党参、枸杞子4味中药材组成的中药复方制剂，本研究通过色谱分离技术对处方中主要成分进行定性、定量分析。进一步提升了龟鹿二仙口服液质控水平，由于处方中成分复杂，分离困难、干扰多，通过上阴、阳离子树脂柱进行洗脱，除去氨基酸、蛋白质、多糖等成分，达到纯化供试品溶液的目的，使含量测定结果准确可靠。

原标准中仅采用定氮法测总氮量，专属性不强、产品质量标准较低。通过对处方成分分析，对产品中枸杞子有效成分之一甜菜碱进行研究，建立了HPLC含量测定方法。甜菜碱系甘氨酸的三甲基衍生物，季胺型水溶性生物碱，基本结构为(CH3)3-N+-CH2-COO-，分子式为C5Hl1N02，分子质量为117.11，无共轭结构。纯化方法曾采用0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液及1 mol·L-1三乙胺的乙腈溶液衍生后测定，发现衍生后未检测出理想甜菜碱成分峰；样品采用单阳离子柱洗脱后，测得成分峰很多且有重叠，甜菜碱成分分离度不理想。供试品选用上阴、阳离子柱洗脱处理后，杂质成分较少，没有出现干扰峰，且甜菜碱成分峰分离度较好。

本文对处方中全部药味均进行了薄层鉴别，在甘氨酸鉴别中，最初采用正丁醇-乙酸-水(3∶1∶1)为展开剂，但存在拖尾及背景干扰等缺点，经摸索，以苯酚-0.5%硼砂水溶液(4∶1)为展开剂时，分离度较好，展开效果理想，且在105 ℃加热10 min再喷显色剂比晾干后显色要好；在显色剂方面，2%茚三酮乙醇溶液比0.2%茚三酮乙醇溶液效果更明显。对党参、枸杞子鉴别中，分别选择各自对照药材作对照，在本实验选择确定的薄层色谱条件下，斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰。

龟鹿二仙口服液选取甜菜碱作为控制制剂质量的首选目标，根据《中华人民共和国药典》2015年版规定[1]，枸杞子药材按干燥品计算，含甜菜碱不得少于0.30%，依据龟鹿二仙口服液处方，建议含量测定限度为不得少于0.15 mg·mL-1。