毛蕊花苷对大鼠递增大强度运动下骨骼肌损伤的保护作用研究

朱洪竹 朱梅菊 蔡荣兴 张崇林 彭勇 伍人乐

摘 要：目的：研究毛蕊花苷对递增大强度运动大鼠骨骼肌损伤的保护作用。方法：SD大鼠随机分为正常对照组（NC）、单纯运动组（SE）、运动+毛蕊花苷低剂量组（EVL）、运动+毛蕊花苷中剂量组（EVM）、运动+毛蕊花苷高剂量组（EVH）。采用递增大强度跑台运动疲劳模型。实验末，取血和骨骼肌检测各组大鼠血清CK酶活性和骨骼肌氧化应激指标及HSP70蛋白表达量，并用光学显微镜观察骨骼肌微细结构改变。结果：1）与SE组相比，毛蕊花苷各剂量组明显减少了运动引起的血清CK活性的上升（P<0.05或P<0.01），减轻了运动所致的骨骼肌微细结构的异常，且EVH组的效果要好于EVL组和EVM组。2）与SE组相比，毛蕊花苷各剂量组显著抑制了运动导致的大鼠骨骼肌的氧化应激水平（P<0.05或P<0.01），其中EVH组抗氧化损伤的效果要好于EVL组和EVM组。3）与SE组相比，毛蕊花苷剂量组进一步诱导了运动引起的HSP70的高表达（P<0.05或P<0.01），其中以EVH组的蛋白表达增加更为显著（P<0.05）。结论：毛蕊花苷对运动大鼠骨骼肌损伤有良好的改善作用，显示出毛蕊花苷有明显抗骨骼肌氧化应激和减轻运动性骨骼肌微细结构损伤的保护作用，其中高剂量补充组的改善效果要优于其他剂量组，这可能与其能更好地诱导运动大鼠骨骼肌内源性保护蛋白（HSP70）表达以发挥HSP70保护效应有关。

关键词：毛蕊花苷;HSP70;氧化应激;骨骼肌损伤;动物实验

中图分类号：G804.7 文献标识码：A文章编号：1006-2076（2019）01-0053-05

过度运动或大强度运动训练会引起疲劳，常常会造成骨骼肌损伤，严重影响运动员的运动成绩和身心健康，而运动性骨骼肌损伤目前临床上尚缺乏有效的防治措施。毛蕊花苷是马先蒿属植物的特征性成分之一[1]，属于苯丙素苷类化合物，该类化合物具有明顯的体外抗骨骼肌疲劳、改善运动小鼠心肌等组织脂质过氧化损伤的作用[2]。但目前有关毛蕊花苷对运动所引起的骨骼肌损伤的保护作用研究很少见。热休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）是一种在高温、炎症、运动损伤等应激条件下诱导高表达的内源性保护蛋白[3-4]，与运动关系密切。近年HSP70已成为较受关注的骨骼肌内源性保护途径之一。毛蕊花苷能否依赖其对HSP70的调节发挥抗骨骼肌损伤的作用，目前研究尚不清楚。本研究拟通过建立递增大强度跑台运动疲劳模型，观察毛蕊花苷对运动大鼠血清酶活性的改变、骨骼肌微细结构变化、氧化应激指标及HSP70表达的影响，为毛蕊花苷作为一种有效的、纯天然的抗骨骼肌损伤的防治方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

68只体质量（160±20）g的雄性SPF级SD大鼠，购自中国科学院上海实验动物中心湖南斯莱克景达实验动物公司（SCXK（湘）2011-0003），置于室温（23±0.5）℃，湿度40%～60%的环境下饲养。适应3天后，随机分为正常对照组（NC）、单纯运动组（SE）、运动+毛蕊花苷低剂量组（EVL）、运动+毛蕊花苷中剂量组（EVM）、运动+毛蕊花苷高剂量组（EVH），共5组，除NC组8只外，其余均15只。分笼饲养，自由饮食饮水。

1.2 药物灌胃处理

毛蕊花苷，纯度99%，购于北京索莱宝科技有限公司。药物剂量换算参照文献[5]，临用前用生理盐水混悬，配成相应浓度的药液。运动+毛蕊花苷低、中、高剂量组（EVL、EVM、EVH），分别按1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，每天灌胃毛蕊花苷，灌胃体积2 ml/只。正常对照组和单纯运动组用等体积的生理盐水灌胃。1次/天，连续灌胃3周，每次在训练前2 h内进行。

1.3 运动干预方案

跑台运动方式是参照文献[6-7]方法并结合预实验经验后改良的。除正常对照组外，其余各组大鼠在坡度为0°的ZH-PT动物实验跑台（安徽淮北正华）上进行递增负荷强度运动，并采用声、光、电刺激对消极跑动或者不跑的大鼠进行驱赶。每天观察并记录大鼠的一般情况。正常对照组大鼠以同样的条件常规喂养，自由活动，但不施加跑台训练干预。训练时间3周，7天/周，每天1次（具体见表1）。

1.4 主要试剂

免抗鼠HSP70为多克隆抗体，购于武汉博士德生物工程公司。CK、T-SOD、GSH-Px、MDA及考马斯亮蓝蛋白测试盒均购自南京建成生物有限公司，并严格按测试盒的说明书进行操作。

1.5 动物取材与指标检测

1.5.1 动物取材

末次训练结束后，大鼠称重，用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）对大鼠腹腔麻醉，心脏采血，分离血清，待测CK活性。冰浴上分离腓肠肌组织，生理盐水漂洗滤纸吸干后，标记分装，一份置10%甲醛溶液中固定作光镜标本，另一份置液氮中保存，用作HSP70蛋白表达检测。

1.5.2 指标检测与方法

1）骨骼肌HE染色切片制备及观察 固定后的样品按常规方法制备石蜡切片，在BX41型光学显微镜（日本，OLYMPUS公司）下，观察骨骼肌肌纤维、小血管、肌外膜及炎症细胞浸润等结构的改变。

2）血清CK活性、骨骼肌T-SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量 采用生化法（德国，ECOM-F1624型半自动生化分析仪）。

3）HSP70 Western-blotting检测 取冷冻腓肠肌组织100 mg加入PIPA裂解缓冲液，匀浆、12 000 rpm离心30 min（4℃）、取上清。取少量上清液进行BCA法总蛋白定量。按常规方法上样、电泳、转膜、封闭、加一抗（抗体工作浓度为1：500）、二抗后，再依次洗膜、显影、定影、扫描。用EC3凝胶电泳成像分析软件（America）系统记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行定量分析。GAPDH作为内参，计算各组蛋白的相对表达量。

1.6 数据处理

采用SPSS16.0统计软件，统计结果以均数±标准差（Mean±SD）表示。多组间差异比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各组大鼠一般情况

正常对照组（NC）大鼠表现活跃，两眼有神，神态安祥;单纯运动组（SE）大鼠运动后表现为两眼无神，活动次数降低，迟钝、逃避反应能力差，毛发稀少无光泽等神疲症状;毛蕊花苷各剂量组上述疲劳症状明显减轻。

2.2 各组大鼠血清CK活性、骨骼肌T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的变化

与NC组相比，SE组和毛蕊花苷各剂量干预组（EVL、EVM、EVH）血清CK活性均有升高（均P<0.01）;与SE组相比，EVL、EVM、EVH各干预组血清CK活性均有降低（P<0.05或P<0.01），其中EVH组降低最为明显且低于EVL组（P<0.05）（见表2）。

与NC组相比，SE组和毛蕊花苷各剂量干预组（EVL、EVM、EVH）骨骼肌T-SOD、GSH-Px活性均有下降（P<0.05或P<0.01）;与SE组相比，EVL、EVM、EVH干预各组两指标均有增加，其中EVH组增加尤为明显（P<0.01），且GSH-Px活性显著高于EVL组（P<0.01）。而MDA含量则呈现相反的趋势：EVL、EVM、EVH各干预组均低于SE组（P<0.05或P<0.01），以EVH组降低最为明显，且低于EVL组（P<0.05）（见表2）。

2.3 光镜观察结果

光镜下，正常对照组骨骼肌细胞肌纤维排列整齐，多核，肌膜下可见肌细胞核呈扁椭圆形且分布均匀;单纯运动组（即本实验的运动模型组）部分肌纤维有肿胀、扭曲、节段性断裂和溶解甚至消失等损伤现象;运动+毛蕊花苷各剂量组肌纤维排列渐趋整齐，部分肌纤维扭曲、断裂损伤等现象较运动模型组均有减轻，其中尤以高剂量组改善效果最好。

2.4 各组大鼠骨骼肌HSP70蛋白表达的变化

NC组可见少量的HSP70蛋白表达，模型运动SE组HSP70的蛋白表达量较NC组明显增加（P<0.01）。运动+毛蕊花苷各剂量组HSP70蛋白表达明显高于SE组（P<0.05或P<0.01），其中高剂量补充的EVH组增加更为显著，且分别高于中、低剂量补充的EVM组和EVL组（均P<0.01）。

3 讨论

运动引起骨骼肌细胞膜结构和功能发生改变，导致骨骼肌肌肉损伤，血清肌酸肌酶（Creatine Kinase，CK）会增加[8]。血清CK活性是间接反映骨骼肌损伤的一个敏感指标，且与肌损伤程度呈正相关[9-10]。本研究结果显示，运动后CK酶活性的显著增加，且高出正常水平的近3倍，提示本研究的递增强度运动引起了大鼠骨骼肌的损伤。此外，HE染色病理切片同时显示单纯运动SE组骨骼肌出现了肌纤维排列异常，节段性断裂损伤、溶解甚至消失等病理现象，从形态学方面进一步佐证了骨骼肌损伤这一特征。过度运动或大强度运动会导致机体受损，诱发骨骼肌纤维微细结构损伤，并引起HSP70高表达[11-12]。有研究显示，运动诱导HSP70表达的增加与运动负荷大小和运动周期有关，大鼠心肌HSP70的表达只有在跑速达到或超过24 m/min时才增加[8]。本研究采用3周递增大强度跑台运动疲劳模型[13]，通过检测运动大鼠HSP70表达，发现模型运动SE组大鼠骨骼肌HSP70被强烈诱导表达，这是由于运动引起的高温、机械应力、运动损伤、自由基生成、细胞内Ca2+浓度升高等应激因素引起细胞结构与功能改变和蛋白质变性损伤，诱导了HSP70的表达上调[14-16]。HSP70的表达量越大，说明机体损伤越严重，应激反应越剧烈，与先前研究相类似[17]。

本研究结果同时显示，SE组大鼠骨骼肌脂质过氧化产物-丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量明显上升，高于NC组，而总超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）活性则降低，提示运动大鼠抗氧化能力降低，机体自由基生成增加，氧化应激反应增强。这可能与长时间的大强度运动引起的骨骼肌耗氧量增加，机体处于相对缺血缺氧状态有关。机体缺血缺氧产生的过多氧自由基通过脂质过氧化反应使肌细胞膜发生过氧化损伤，骨骼肌受损，进而诱导HSP70高表达[18]。HSP70是一种重要的应激蛋白，是细胞内环境稳定的、强有力的、内源性保护途径[19]。随着3周递增强度运动诱导产生HSP70的累积，HSP70可能与运动应激后细胞内产生的损伤蛋白质结合，发挥其分子伴侣功能，维持细胞结构的稳定[20]。这是機体应激后产生的一种内源性骨骼肌保护作用机制[21]，其具体机制尚待阐明。

HSP70是一种重要的分子伴侣，其骨骼肌保护作用已被实验研究所证实[8，11]。HSP70已成为较受关注的骨骼肌内源性保护途径之一。毛蕊花苷属于苯丙素苷类化合物，抗氧化作用是该类化合物的主要活性之一[22];其清除氧自由基和抗氧化损伤的能力可能依赖于分子中羟基的数目;毛蕊花苷有两个相同的苯酚环，其中每个苯酚环上均有两个邻位羟基，分子中羟基的数目越多，抗氧化损伤的能力就越强[23]。研究已表明毛蕊花苷有抗运动小鼠疲劳和抗骨骼肌线粒体氧化应激损伤等作用，毛蕊花苷对骨骼肌的保护作用能否依赖其对HSP70的调节实现，目前尚不明确。本研究进一步发现，补充毛蕊花苷后，各剂量组的HSP70蛋白表达明显高于未补充药物的运动模型SE组，其中以高剂量补充的EVH组增加更为明显，说明毛蕊花苷有进一步上调递增运动引起的骨骼肌HSP70高表达的作用，且其蛋白表达量与毛蕊花苷呈剂量依赖关系;同时骨骼肌抗氧化酶（T-SOD和GSH-Px）活性也显著高于SE组，而MDA含量则明显降低，血清CK活性明显下降，骨骼肌微细结构损伤有所好转，大鼠疲劳症状有所改善，且高剂量毛蕊花苷补充组的效果要好于其他剂量组。提示，毛蕊花苷有可能通过诱导HSP70高表达来实现对损伤蛋白的修复作用而发挥保护效应。研究表明，诱导型HSP70可减轻氧化应激所致的心肌损伤，HSP70对组织缺血再灌注损伤的保护作用可能是通过抗氧化酶（Mn-SOD）的增加来实现减少自由基对机体的损害[24]。以上表明毛蕊花苷提高运动大鼠抗氧化能力，减少脂质过氧化产物对骨骼肌的损伤，保护骨骼肌功能，其抗运动性骨骼肌损伤的作用有可能是通过内源性保护蛋白（HSP70）所介导。此外，毛蕊花苷还能通过提高运动大鼠骨骼肌细胞肌浆网Ca2+-ATP 酶活性，促进细胞内Ca2+转运，有较明显的抗运动疲劳和提高大鼠运动能力作用[13]。毛蕊花苷与骨骼肌损伤的关系还待进一步研究。通过有针对性地补充外源性药物活性成分或运动营养补剂，诱导内源性保护蛋白（HSP70）的合理表达，调动机体内源性自我保护机制[12]，可以减轻运动所引起的骨骼肌损伤。也提示通过补充毛蕊花苷提高HSP70表达以发挥HSP70的细胞保护效应成为可能。

4 小結

递增强度运动可引起骨骼肌损伤，补充毛蕊花苷后对机体有良好的保护作用，且高剂量组的效果要好于其他剂量组，其机理可能是毛蕊花苷能较好地上调运动引起的骨骼肌内源性保护蛋白（HSP70）高表达，提高骨骼肌抗氧化能力，减少大强度运动对机体造成的脂质过氧化损伤。

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