PTEN基因过表达对BMSCs迁移的影响

汪显耀 贺丽虹 许键炜 卢俊厚 张焕相△ 何志旭，3*

(1.贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州 贵阳 550004；2.苏州大学干细胞与组织工程实验室，江苏 苏州 215123；3.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004)

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于器官间质和结缔组织中，以骨髓中含量最为丰富，故又称为骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)[1-2]。研究[3]表明，BMSCs表现出较高的运动及趋向病灶区域迁移的能力。然而，成功迁移至损伤或病变部位的细胞数极少，修复和治疗效果非常有限。因此，提高BMSCs的定向迁移能力，增加迁移到损伤或病变部位的移植细胞数量至关重要。

PTEN基因又称为肿瘤抑制基因，中文名为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因，位于10q23，属于PTP(protein tyrosine phosphatases)基因家族成员，与癌症的发生和发展密切相关。PTEN基因编码一种肿瘤抑制因子，通过阻止细胞生长、分裂的速度过快，进而调控细胞分裂周期。研究表明，大部分癌症患者都有PTEN基因的突变或缺失，包括非小细胞癌[4]、前列腺癌[5-6]、胃癌[7]和结直肠癌[8]等。而在BMSCs中， PTEN基因的研究鲜有报道。本文通过构建Ad-PTEN重组腺病毒载体，并利用293A细胞包装重组腺病毒。通过体外实验探究PTEN基因对BMSCs细胞迁移的影响，为深入研究PTEN基因对BMSCs的迁移机制奠定基础。

1 材料方法

1.1实验动物 清洁级Sprague Dawley(SD)大鼠，体重约150 g，由贵州医科大学实验动物中心提供。本研究动物实验依照《中华人民共和国实验动物管理条例》和《贵州医科大学实验动物管理办法》实施执行。

1.2主要材料及试剂 pAdTrack-CMV质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1均由苏州大学杨吉成教授惠赠。pMD19-T载体购自Takara公 司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，限制性内切酶Kpn I和Xba I，Pac I酶和DNA marker(Takara公司)、质粒抽提试剂盒和Trizol Reagent(Invitrogen公司)、dNTP Mix 和 Taq DNA polymerase酶 (Takara公 司)、琼脂糖、氨苄青霉素和卡那霉素(Sigma公司)、DNA回收试剂盒(QIAGEN公 司)。QBI-293A细胞由苏州大学干细胞与组织工程实验室保存。1640细胞培养基、L-DMEM细胞培养基、双抗、胰酶均购自Hyclone公司，FBS(BI公司)，RNA逆转录试剂盒和定量PCR试剂盒购自Thermo公司。细胞培养皿、培养瓶、离心管、冻存管、移液枪头等均购自Corning公司。

1.3方法

1.3.1BMSCs细胞分离培养 SD大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死。全骨髓培养法分离培养BMSCs，按1∶2比例传代培养。实验所用细胞为状态良好的第3～10代细胞。

1.3.2cDNA模板的获得 BMSCs细胞PBS清洗2遍，Trizol法提取RNA，检测RNA浓度和A260/A280值，通过反转录获得cDNA。-20 ℃保存制备好的cDNA以备用。

1.3.3PCR反应扩增大鼠PTEN基因 查询NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站，得到大鼠PTEN(NCBI登入号：NM_031606.1)的编码区序列。针对PTEN序列设计含有Kpn I和Xba I限制性酶切位点的PCR引物，PTEN-sense：5’ CTGGGTACCATGACAGCCATCATCAAAG 3’，PTEN-antisense：5’GGCTCTAGATCAGACTTTTGTAATTTGTG 3’。划线部分为酶切位点，分别为Kpn I和Xba I，序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以1.3.2产物为模板，退火温度60 ℃进行PCR克隆PTEN，1% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.3.4PCR产物与pMD-T载体的连接 将pMD19-T载体与1.3.3获得的PCR产物在16 ℃进行连接反应，连接30 min。体系为：PCR产物(1 μL)、pMD19-T载体(2.6 μL)、Solution I(5 μL)、ddH2O(1.4 μL)。连接产物通过钙转法转化至感受态细胞DH5α中，氨苄青霉素筛选阳性菌落。挑取单菌落摇菌培养，抽提质粒，将提取的质粒进行Kpn I和Xba I双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳验证。取鉴定正确的阳性克隆，送上海生工进行测序鉴定。测序得到的结果使用DNAMan软件进行比对，将比对完全正确的克隆命名为pMD19-T-PTEN，保存菌种并提取质粒以备后续实验。

1.3.5Ad-PTEN重组腺病毒载体的构建及鉴定 pMD19-T-PTEN进行Kpn I和Xba I双酶切后，凝胶回收目的基因片段，使用T4 DNA连接酶与同样进行Kpn I和Xba I双酶切处理的pAdTrack-CMV穿梭载体进行连接反应，将连接产物转化XLB感受态细胞，挑取阳性单克隆，摇菌培养并提取质粒，进行Kpn I和Xba I双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳验证。腺病毒骨架载体pAdEasy-1转化至DNA重组活跃的BJ5183菌株中，在Amp+抗性下培养并摇培制备重组感受态细胞，接着将与穿梭载体连接正确的质粒进行Pme I酶切线性化处理以暴露其同源重组位点，将线性化产物与pAdEasy-1载体在上述制备的重组感受态细胞中进行同源重组，使用Kan+抗性的LB平板初步筛选重组成功的克隆。利用Pac I酶切鉴定，将重组的载体作PCR，分别1%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.3.6腺病毒包装 将重组成功腺病毒载体通过Pac I酶切，根据lipofectamine 2000操作说明转染QBI-293A细胞进行病毒的包装。7～10 d后收集感染的QBI-293A细胞，在-80 ℃与室温间反复冻融3次后，5 000 rpm，离心5 min，将上清液加入新的QBI-293A细胞进行反复感染和扩增获得高滴度的病毒液，-80 ℃保存。

1.3.7Western blot 细胞感染病毒后48 h， PBS清洗2遍，加入液氮，以200 μL细胞裂解液提取总蛋白，用BCA试剂盒检测所提蛋白的浓度。将蛋白与4×上样缓冲液混合，95°C加热变性10 min，冰上冷却，分装，-80 ℃保存，常规Western blot电泳法检测蛋白表达情况。

1.3.8划痕实验 细胞按照105/mL密度接种6孔板，细胞贴壁后感染病毒，48 h后以黄色枪头于皿底十字划线，12 h后倒置显微镜下拍照，统计划痕愈合率。划痕愈合率=(原始划痕面积-剩余划痕面积)/原始划痕面积×100%。

1.3.9Boyden chamber Boyden chamber下室加入30 μL含2% FBS的细胞培养基，以孔径8 μm的多聚赖氨酸PLL包被的PVP-free polycarbonate membrane盖住下室，依次盖上软塑片和硬塑片，避免气泡产生。细胞准备成8×105/mL的单细胞悬液，50 μL的单细胞悬液接种在Boyden chamber的上室，细胞培养箱中培养5 h。细胞刮刀刮去未迁移的细胞，4%多聚甲醛中室温固定30 min，5%结晶紫中染色15 min，自来水漂洗后于倒置相差显微镜下拍照，统计迁移至膜下方的细胞数。将对照组的迁移细胞数标准化定义为1。

2 结 果

2.1PTEN基因PCR产物与pMD19-T克隆载体的构建 如图1 A，凝胶电泳结果显示在1200 bp处出现目的条带。将提取的质粒进行Kpn I和Xba I双酶切，在1200 bp处成功获得目的片段(图1 B)。送上海生工进行测序鉴定，测序得到的结果使用DNAMan软件进行比对，比对结果显示克隆序列与GenBank中人的序列一致。

2.2Ad-PTEN重组腺病毒载体的构建及鉴定 结果显示成功切出穿梭载体片段和目的片段(图2 A)，进行Pme I酶切线性化处理以暴露其同源重组位点(图2 B)，如图2 C所示重组质粒经Pac I单酶切成功切出约30 Kb的大片段和3 Kb左右的小片段；将重组的载体进行PCR鉴定，结果显示在相应位置成功扩增出PTEN基因(图2 D)。

注：图A为PCR获得目的产物，M.marker；PTEN：1212 bp。图B为pMD19-T载体与PTEN连接产物以Kpn I和Xba I双酶切鉴定，M.marker；1.pMD19-T-PTEN双酶切产物(片段大小分别为2692 bp和1212 bp)。

图1PTEN的扩增与TA克隆

注：图A为pAdTrack-CMV-PTEN以Kpn I和Xba I双酶切鉴定，M.marker；1.pAdTrack-CMV；2.pAdTrack-CMV-PTEN；3.pAdTrack-CMV-PTEN以Kpn I和Xba I双酶切产物。图B为pAdTrack-CMV-PTEN进行Pme I单酶切线性化处理，M.marker；1.pAdTrack-CMV-PTEN以Pme I单酶切产物。图C为Ad-PTEN同源重组克隆Pac I单酶切鉴定，M.marker；1.Ad-PTEN Pac I酶切鉴定。图D为Ad-PTEN同源重组克隆PCR鉴定，M.marker；1.Ad-PTEN PCR鉴定产物。

图2Ad-PTEN重组腺病毒载体的构建

2.3Ad-PTEN腺病毒包装 见图3，利用荧光显微镜观察GFP的表达情况以确定转染效率和包装的进度。9 d后，收集细胞反复冻融获得重组病毒子Ad-PTEN，进行多次扩增，产生滴度为5×107Pfu/mL的病毒，-80 ℃保存备用。

2.4PTEN基因过表达抑制BMSCs的迁移 Ad-PTEN感染BMSCs 48 h后，PTEN表达相对于对照组显著上调，见图4。以Ad、Ad-PTEN感染BMSCs，48 h后十字划痕，12 h荧光显微镜下观察划痕愈合情况并计算划痕愈合率。见图5，高表达PTEN基因后，细胞划痕愈合率为(23.45±2.57)%，而对照组划痕愈合率为(44.76±2.2)%，说明高表达PTEN基因显著抑制细胞划痕愈合率。Boyden chamber检测显示，高表达PTEN基因后，细胞相对迁移数为(0.39±0.03)，说明高表达PTEN基因显著抑制细胞迁移，见图6。

注：以Ad、Ad-PTEN感染MSCs，48 h后提取总蛋白，Western blot检测PTEN的表达。以β-actin为内参，将MSCs感染Ad后PTEN的相对表达量标准化为1，与Ad相比，*P<0.05。

图4Western blot检测MSCs感染Ad-PTEN后PTEN的表达

注：以Ad、Ad-PTEN感染BMSCs，48 h后按照之前Boyden chamber方法进行实验。

图6Boyden chamber检测BMSCs感染Ad-PTEN后细胞迁移能力变化

3 讨 论

间充质干细胞(MSCs)是一种中胚层来源的多能成体干细胞。具有容易扩增，低免疫原性等特点，成为干细胞治疗和组织再生的理想种子细胞。之前研究发现，MSCs能明显改善脊髓损伤胶质瘢痕的形成[9]，能显著提高放射性皮肤溃疡创面愈合率等[10]。 MSCs向病变部位的迁移是细胞移植治疗的关键，但在体内研究中发现只有少量的移植细胞迁移到损伤或病变部位，修复和治疗效果十分有限[11-12]。因此，如何提高MSCs的迁移能力，增加迁移到损伤或病变部位的移植细胞数量是改善疗效的关键。

PTEN基因又称为肿瘤抑制基因，与癌症的发生和发展密切相关[13-14]。PTEN的脂质磷酸酶活性导致PIP3去磷酸化生成PIP2，导致PI3K对Akt的磷酸化作用被阻断，负调控PI3K/Akt信号通路[15]。在癌细胞中，PTEN基因的缺失或突变，主要导致Akt信号的过度活化，这也是癌细胞过去增殖和侵袭的主要原因[16-17]。但是在BMSCs中，对PTEN基因的研究鲜有报道。本文通过构建Ad-PTEN重组腺病毒载体，利用293A细胞成功包装出高滴度的重组腺病毒。通过Western blot验证，Ad-PTEN上调BMSCs细胞中PTEN的表达。以Ad-PTEN上调BMSCs细胞中PTEN基因的表达，结果发现BMSCs的迁移能力明显受到抑制，表明，PTEN基因高表达显著抑制BMSCs的迁移。这为BMSCs的迁移机制研究和临床应用提供了重要线索。

综上，PTEN基因在BMSCs迁移中起着重要的作用。但是，目前PTEN基因在BMSCs细胞中的生物学功能及其具体作用机制尚未见报道，有待进一步深入研究。