蛋白酶抑制子在植物与病原物互作中的作用*

王长春， 刘真真， 叶 涛， 刘 敏， 韩佳峰， 吴园园， 杨 玲

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

蛋白酶是通过水解肽键将蛋白质降解为氨基酸或多肽，不可逆决定蛋白质最终去向的一类酶，对于生物体的生长发育与环境适应性均有着非常重要的作用[1].如何从时空上精确调控蛋白酶的活性，使其在正确的时空中发挥功能，对于植物的生长发育与抗逆性非常关键.蛋白酶的水解活性受到PIs的严格调控[2]，研究表明，PIs在植物抗病性、免疫应答[3]与细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)[4]等生理过程中发挥着极其重要的作用.

1 PIs的特征及分类

PIs是一类能与蛋白酶产生特殊相互作用以抑制蛋白酶活性的多肽和蛋白质，普遍存在于动植物及微生物体内.它的基本特点是分子量较低，通常由30个以上氨基酸组成，个别较大的可达到400多个氨基酸[5]；分子内半胱氨酸含量相对较高，一般不含有内含子[6].PIs能与相应的蛋白水解酶在生物体内形成动态平衡[7]，它们的具体作用方式是通过“位阻”来抑制底物与蛋白酶活性位点结合[2,8-9].在植物中，PIs可作为植物贮藏蛋白存在于块茎、种子、果实等器官中[10]，特别是种子中含量丰富，高达总蛋白的10%[11].

根据对底物蛋白酶的抑制特性，Laskowski等[12]将蛋白质类PIs系统地分为4大类：丝氨酸蛋白酶抑制子(serine proteinase inhibitor)、半胱氨酸蛋白酶抑制子(cysteine proteinase inhibitor)、金属蛋白酶抑制子(metalloproteinase inhibitor)和酸性蛋白酶抑制子(acid proteinase inhibitor).目前研究较多的是丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制子，其中丝氨酸蛋白酶抑制子已经发现1 500余个成员[13].随后，Rawlings等[14]根据PIs的功能结构域氨基酸序列的同源性和折叠特点，将PIs分为48个家族；随着更多基因组测序的完成，在最新的分类系统中，PIs被分为83个家族[15](http:/www.ebi.ac.uk/merops/).

2 PIs在植物与病原物互作中的作用

在植物与病原物的互作过程中，病原微生物分泌大量的效应子来增强致病性，这些效应蛋白就包括降解植物抗病相关蛋白的蛋白酶和抑制植物蛋白酶的PIs.相反，植物自身也会分泌蛋白酶和PIs来应答病原物蛋白酶和PIs，诱发防御反应，进而提高对病原物的抗性，这是在植物与病原物互作中重要的防御或进攻手段，其互作过程相对复杂，涉及到不同信号通路的激活.因此，PIs是植物抗病性的主要系统之一，在植物与病原物的互作中起着重要的作用.

2.1 植物PIs在植物与病原体互作中的作用

2.1.1 PIs能够抑制病原物的生长

PIs作为植物体本身存在的病程相关蛋白，当植物受到病原物侵袭时所表现出最为普遍的防御反应就是激活自身PIs基因来提高自身抗病能力[16]，随着被侵染部位致病症状的出现，植物体会产生更多的PIs.植物PIs通过抑制病原体蛋白酶或调节内源性植物蛋白酶抑制病原物，但具体作用机制不详.超表达水稻半胱氨酸蛋白酶抑制子的烟草植株表现出对烟草蚀刻病毒(Tobaccoetchvirus，TEV)与马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)的抗性显著增强[17-18].花生中胰蛋白酶抑制子经纯化后可显著抑制黄曲霉(Aspergillusflavus)孢子的萌发和菌丝的生长[19].从蒺藜苜蓿中分离出一种名为蛋白酶抑制子I4(MtPiI4)的基因，超表达MtPiI4转基因拟南芥植株表现出对丁香假单胞菌番茄致病菌更强的抗性[20].在疫霉侵染时，马铃薯叶片会诱导产生丝氨酸蛋白酶抑制子PLPKI，该抑制子特异性抑制致病疫霉(Phytophthorainfestans)与立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)分泌的胞外蛋白酶，PLPKI的表达量与马铃薯对疫霉的水平抗性强弱成正相关，表明马铃薯可能通过分泌PLPKI来免受卵菌的侵染[21].从巴西橡胶树中分离了一种蛋白酶抑制子，可以增强对红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)的抗性[22].从黄秋葵种子中分离的一种凝集素，具有胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶抑制子活性，对根结线虫具有直接的毒性[23].这些研究结果表明，植物PIs可能是通过抑制病原物蛋白酶活性使得病原物得不到充足的氨基酸进而使生长增殖受阻，从而提高抗病性.

2.1.2 PIs在植物信号转导中的作用

在玉米与瘤黑粉(Ustilagomaydis)的互作中，内源水杨酸诱导半胱氨酸蛋白酶在提高对瘤黑粉病的抗性中起着重要作用.这些蛋白酶的表达可以被过表达半胱氨酸蛋白酶抑制子CC9抑制.瘤黑粉菌利用这一特点，在侵染玉米时，通过分泌效应子pep1诱导CC9表达以抑制玉米的防御反应，CC9是蛋白酶抑制子，它的功能主要是抑制蛋白酶的活性.在该研究中,CC9除具有抑制与抗病相关的蛋白酶活性功能外，还具有抑制这些蛋白酶表达的功能[3].说明蛋白酶抑制子是抗病信号中的重要组分.由于尚未鉴定到与CC9直接互作的蛋白，因此无法确认是CC9抑制蛋白酶活性反馈抑制了蛋白酶基因的表达还是CC9与其他蛋白互作抑制蛋白酶的表达.一种Kunitz型胰蛋白酶抑制子LeMir(LycopersiconesculentumMiraculin)在番茄抗叶霉菌基因介导的过敏性坏死(hypersensitive response，HR)产生的Peronospora tabacina Adam前后表达量具有显著差异.超表达LeMir的植株显著诱导Cf介导的HR的产生；而在沉默LeMir后的番茄植株上Cf介导的HR明显减弱[24].由于该研究未涉及病原物，推测LeMir可能参与Cf基因介导的HR信号转导过程.

2.1.3 植物PIs参与调控细胞程序性死亡

细胞程序性死亡也是植物中PIs调控的生理过程之一[25-26].烟草中的一种新型半胱氨酸蛋白酶抑制子基因NtCYS对胚细胞的程序性死亡具有重要的调控作用[27].有研究发现[4]，在敲除拟南芥中的一种Kunitz蛋白酶抑制子基因Atwscp(与拟南芥花粉发育相关的十字花科水溶性叶绿素蛋白)的突变体中，出现花粉早熟并产生细胞死亡现象，且胚珠受精、胚胎发育和种子形成均受到不同程度的影响.说明Kunitz蛋白酶抑制子Atwscp基因在花粉管的PCD中起着重要的调控作用.定位于辣椒中质膜的半胱氨酸蛋白酶抑制子CaPR4c参与植物细胞PCD的调控过程[28]，野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonascampestris)Ⅲ型效应子AvrBsT触发程序性细胞死亡并激活植物的HR.AvrBsT可以快速和特异性诱导CaPR4c表达，而CaPR4c的瞬时表达导致辣椒叶片细胞出现HR，并伴随着一些防御反应基因表达量升高.CaPR4c沉默的辣椒中PCD的诱导和防卫反应基因表达均明显降低.因此,认为AvrBsT通过特异性诱导CaPR4c的表达而导致HR的产生；超表达CaPR4c的拟南芥对丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)抗性显著增强.ATMC1是半胱氨酸蛋白酶抑制子，该基因在拟南芥或其他植物中过量表达会导致过敏性坏死[29].因此,ATMC1的表达量必须被精确调控.ATMC1在拟南芥中有2种存在形式：无N端的前导肽的剪切型和非剪切型，剪切型具有更强的促坏死活性.拟南芥丝氨酸蛋白酶抑制子AtSerpin1可以与非剪切型的ATMC1互作，不仅抑制ATMC1自我剪切，而且抑制了依赖于ATMC1介导的HR[30].上述研究结果表明，蛋白酶抑制子在植物发育和抗病性PCD中具有重要的作用，所不同的是有的是正向调控PCD，有的是负向调控PCD，说明PIs功能复杂，需逐个深入研究.

2.2 病原体PIs在植物与病原体互作中的作用

2.2.1 病原体PIs增强宿主的致病性

为了增强宿主的致病性，病原物在侵染植物的过程中也会分泌大量的效应子,这些效应子包括降解植物抗菌蛋白的蛋白酶和抑制植物蛋白酶具有抗菌活性的PIs[31]，调控宿主防御系统来增强致病性.已有诸多研究证明，来自病原体的PIs具有抑制不同的宿主蛋白酶的功能.叶霉菌(Cladosporiumfulvum)侵染番茄时分泌的效应子Avr2是一种半胱氨酸蛋白酶抑制子，体外活性检测证明Avr2抑制番茄质外体木瓜丝氨酸蛋白酶PLCPs (papain-like cysteine proteases)类的Rcr3和Pip1.Rcr3是番茄中的半胱氨酸蛋白酶，对于Avr2介导的HR是必须的.Rcr3蛋白活性丧失特异性地降低了对番茄叶霉菌的抗性.Avr2可以抑制Rcr3蛋白酶活性，增强了叶霉菌对番茄的致病性.超表达Avr2的番茄植株对其他致病真菌包括灰霉病菌(Botrytiscinerea)和黄萎病菌(Verticilliumdahliae)的敏感程度显著增强，这说明Avr2还可能通过抑制宿主中的其他蛋白酶来降低植物的抗病性[32].EPIC1和EPIC2B是致病疫霉侵染番茄时分泌的半胱氨酸蛋白酶抑制子，它们可以与Rcr3发生物理性互作抑制其半胱氨酸蛋白酶活性，Rcr3的突变降低了对致病疫霉的抗性[33].类枯草杆菌蛋白酶的丝氨酸蛋白酶P69B是病程相关蛋白，它的表达受多种病原物诱导.由致病疫霉(Phytophthorainfestans)分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶抑制子EPI1(extracellular proteinase inhibitor 1)含有2个与Kazal族的丝氨酸蛋白酶抑制子高度同源的功能域.EPI1不仅特异性地抑制枯草杆菌蛋白酶A活性，而且还能与P69B互作抑制丝氨酸蛋白酶活性.与EPI1结构类似的EPI10也同样可以与P69B发生特异性互作，抑制枯草杆菌蛋白酶活性.由玉米瘤黑粉菌分泌的半胱氨酸蛋白酶抑制子Pit2对与玉米防御病原体密切相关的3种半胱氨酸蛋白酶(CP2,CP1A和CP1B)表现出显著的抑制作用[34].上述研究表明，由不同类型的真菌和卵菌病原体分泌的半胱氨酸蛋白酶抑制子和丝氨酸蛋白酶抑制子均在不同程度上对抑制宿主防御系统或增强自身致病性起着至关重要的作用.

2.2.2 病原体PIs提高宿主的抗病性

Silva等[35]发现烟霜霉病菌(PeronosporatabacinaAdam)丝氨酸蛋白酶抑制子基因NmIMSP(N. megalosiphon inhibitor of microbial serine proteinase gene)在烟草中瞬时表达会表现出对霜霉病较高的抗性，而沉默NmIMSP的植株对霜霉病抗性明显变小，这是微生物丝氨酸蛋白酶抑制子作为抑制卵菌生长的首个证据.

3 总结与展望

综上所述，PIs在植物的基础抗性及程序性细胞死亡信号转导过程中均发挥着重要作用.目前在植物或病原物中分析鉴定了较多的蛋白酶，且一部分蛋白酶在植物的抗/感病中的功能有了较为深入的研究.虽然在植物与病原物的基因组中同样有较多的蛋白酶抑制子基因，有关它们的功能研究明显滞后于蛋白酶.因此分析鉴定特异性靶蛋白酶抑制子是今后可能的重要研究领域；其次,由于蛋白酶抑制子与蛋白酶具有较强的亲和性，因此，通过重要的蛋白酶为诱饵，采用多种分子生物学手段，鉴定与蛋白酶直接互作的PIs，可以更有目的性地鉴定调控靶蛋白酶活性的PIs.