根结线虫活体染色条件的优化

高英健，郑雨杭，张琴林，侯钰颖，李 萌，李鸿信，方天一，吕伟兴，赵文超，王绍辉

(北京农学院 植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

根结线虫(Root-knot Nematode, RKN)是植物根系内寄生线虫，包括爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)，南方根结线虫(Meloidogyneincongnita)，花生根结线虫(MeloidogynehaplaChitwood)和北方根结线虫(Meloidogynehapla)等，第二阶段幼虫(J2s)从土壤中的卵孵化，必须找到合适的宿主，机械穿透植物根部，并迁移到维管束组织以完成其生命周期，给生产带来很大的损失[1]。

近年来，关于根结线虫染色方法的报道有很多，如酸性品红染色观察根组织[2];甲苯胺蓝[3]或番红-固绿对染染色观察巨细胞[4];但是这些染色方式均针对于死亡的线虫。对活体幼虫标记所用的染料有异硫氰酸荧光素[5]和荧光素二乙酸酯[6]。本文作者选用的是异硫氰酸荧光素，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)是目前应用最广泛的荧光素，最大吸收光波长为490～495 nm，最大发射光波长520～530 nm，在蓝光或紫外光照射下发出黄绿色荧光。

在之前的研究中，FITC对活体线虫的标记缓冲液的浓度过高，造成线虫的死亡率较高，本文作者对FITC染液的浓度进行了优化，提升了线虫的存活率，可为侵染试验提供更有活力的荧光标记线虫。

1 材料与方法

1.1 试验材料和主要试剂设备

试验所采用的材料为南方根结线虫(Meloidogyneincognita)和番茄CM野生型株系(Solanumlycopersicumcv Castlemart)。

试验中所需的试剂：FITC、章鱼胺盐酸盐、间苯二酚、Sucrose、MS Powder、NaOH、植物凝胶、Pluronic凝胶。

试验中所需的设备：荧光体式显微镜(ZEISS，Discovery.V20)、恒温培养箱、光照培养箱、电子天平、高温灭菌锅。

1.2 试验方法

1.2.1 南方根结线虫的繁育 根结线虫自繁方法如下：用于繁殖根结线虫的株系为易感株系。待植株长到4～5片叶时，将其移栽至20 cm的装有病土的营养钵中，病土和营养钵在使用前需要消毒。接种35～50 d时，观察到其根部有大量淡黄色的卵块时，取出长有卵块的根系。小心的将根系用清水洗干净，挑取上面的卵块，将挑取的卵块放入1%的NaClO溶液中消毒30 s，之后用去离子水冲洗3次。再将卵块放入适量的去离子水中，放至26 ℃恒温箱中孵化2～3 d，收集已孵化出的J2，并计算其密度，用于后续的试验。

1.2.2 番茄幼苗的培育 将番茄种子放入灭过菌的50 mL离心管中，加入适量的灭菌水，放入37 ℃摇床中摇晃6 h。然后在超净工作台中将种子用75%乙醇消毒3 min，4%次氯酸钠消毒8 min，再用灭菌水洗6～8次，将种子放入1/2 MS培养基中铺平，生长7～10 d。

1.2.3 线虫荧光标记条件的设定 前人采用的标记缓冲液浓度为(FITC:0.1 mg/mL、0.5%间苯二酚、30 mmoL章鱼胺盐酸盐)染色时间为6 h[7]，在此基础上设置不同的染液浓度，如表1。

将J2浸入不同浓度的FITC染液中，在黑暗条件下培养3、4和6 h，将染色的线虫同染液一起过孔径76 μm的筛子，用清水冲洗几遍，之后将筛子上的线虫洗脱至培养皿中，将洗脱的线虫置于荧光体式显微镜下观察其显色情况，6次重复。

表1 FITC标记缓冲液浓度梯度Tab.1 FITC labeled buffer concentration gradient

1.2.4 存活率的统计 将染色后的线虫吸取20 μL放在培养皿中，在显微镜下，分别统计20 μL里存活的线虫数量与总共的线虫数量，每个梯度和时间点做20个重复，选取最集中的数值按以下公式计算。方差分析采用Duncan’s多重比较法(P<0.05)，采用SPSS 20.0软件进行相关性分析，实验数据采用平均数±标准差表示。存活率=存活线虫数/总线虫数。

1.2.5 Pluronic凝胶法观察线虫的入侵 Pluronic凝胶溶液的配制方法为：23 g Pluronic粉末融入100 mL灭菌水中，4 ℃持续振荡24 h，待其全部溶解，4 ℃保存。

将标记后的线虫(约30头)悬浮液加入预先分装的Pluronic凝胶中，静置5 min，使J2均匀分布于凝胶中，再将番茄幼苗根部放置于凝胶中，并放置于26 ℃培养箱中。24 h后在荧光体视显微镜下观察根系线虫的入侵情况。

图1 Pluronic凝胶中线虫侵染番茄植株根系示意图Fig.1 Schematic diagram of tomato plant rootsinfected by nematodes in Pluronic gel

2 结果与分析

2.1 线虫存活率统计

根据试验结果可以发现，线虫标记3 h时，D浓度下存活率为78%、E浓度下存活率为95%、F浓度下存活率为97%，存活率相对较高，标记4 h后，线虫在C浓度下存活率为23%、D浓度下存活率为33%、E浓度下存活率为78%、F浓度下存活率为90%，虽然仍有存活，但存活率显著下降，在A、B浓度存活率接近0。标记6 h后，所有浓度的线虫接近死亡状态。

表2 不同标记时间和不同FITC标记缓冲液浓度梯度下线虫存活率

Tab.2 Nematode survival rates at different labeling times and different FITC labeled buffer concentration gradients

缓冲液存活率6 h4 h3 hA0.02±0.016a0.04±0.02 c0.17±0.06dB0.018±0.008a0.05±0.02c0.26±0.02 cdC0.017±0.010 a0.23±0.06c0.30±0.03 cD0.025±0.016 a0.33±0.04b0.78±0.07 bE0.013±0.08 a0.78±0.02 a0.95±0.03 aF0.024±0.015 a0.90±0.04 a0.97±0.02 a

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters indicate statistically different variations atP<0.05.

2.2 不同染液体系和染色时间所标记的线虫荧光强弱的观察

线虫在浓度A-F的条件下标记6 h后观察，在A,B浓度条件下，线虫荧光较亮(图2，A6h和B6h)，在F浓度下线虫的荧光亮度极其微弱。在缩短染色时间后，线虫的存活率虽有明显的上升，但是线虫标记的亮度会相应的减弱，标记3 h与4 h比较线虫的荧光显色情况，E浓度下线虫显色较明显，存活率也相对较高。同时在E浓度条件下标记线虫3 h与4 h的荧光显色亮度相近(图2，E3h和E4h)，但标记3 h的线虫存活率较高，达到95%。综合所有条件，最终确定FITC:0.025 mg/mL、0.25%间苯二酚、15 mol/L章鱼胺盐酸盐的缓冲液浓度，线虫标记3 h是最优的荧光标记条件。将最优条件下标记的线虫注入番茄幼嫩根系旁，发现被标记后的线虫可以从根尖进入植株根系(图3)，仍具有入侵的能力，引起根尖的膨大。

A、B、C、D、E、F分别表示缓冲液A-F浓度下标记的线虫，n=6；Bar:10 μm图2 FITC标记南方根结线虫J2显微观察结果A, B, C, D, E, and F represent the nematodes labeled under the buffer A-F concentration, respectively, n=6; Bar: 10 μmFig.2 Microscopic observation of FITC-labeled M. incognita J2

3 讨 论

FITC的应用十分广泛，是一种常用的荧光探针，主要用于标记多糖、多肽等[8]，对线虫的染色试剂有很多，例如甲苯胺蓝，番红-固绿等，但是这些主要针对死线虫，对于活体线虫的标记时，FITC是主要的荧光染料。根据前人的研究，在染色缓冲液条件为:FITC: 0.1 mg/mL, 0.5%间苯二酚和30 mmoL章鱼胺盐酸盐，染色6 h，线虫被标记的荧光很亮[7]，但其未检测存活率，我们在该浓度下标记的线虫亮度和前人研究相一致(如图2,A6h)，但线虫存活率很低，几乎为0(如表2)，线虫存活是后续研究所需的最基本的条件，因此，在我们的研究中发现，通过降低FITC、间苯二酚、以及章鱼胺盐酸盐的浓度和缩短染色时间，可以提高线虫的存活率。在表2中可以发现在标记线虫3 h的存活率较高。在保证线虫存活的条件下考虑标记的亮度，因此舍弃了6 h的标记时间以及a，b两个缓冲液浓度。可以发现e浓度在标记3 h、4 h的亮度相对较亮，因此，选择了在e浓度标记3 h作为最优的标记条件。在最优的标记条件下被标记的线虫具有入侵植物根尖的活力。因此这个方法降低了染液浓度，缩短了染色时间，增加了线虫的存活率，减少了试剂的用量，可以用于靶向和沉默特定的线虫基因，以改变寄主植物的抗性[9]。

a、b、c、d表示线虫FITC:0.025 mg/mL、0.25%间苯二酚、15 mmoL章鱼胺盐酸盐的缓冲液浓度标记3 h的入侵情况，N:线虫，Bar:20 μm图3 南方根结线虫J2s入侵情况显微观察 a, b, c, d represent the invasion of nematodes marked with FITC: 0.025 mg/ml, 0.25% resorcinol, 15mmoL octopamine hydrochloride for 3 h, N: nematodes;Bar:20 μmFig.3 Microscopy observation of the invasion of M. incognita J2s