菌株SDB1-2的筛选及其对垃圾渗滤液处理的应用

张 超，尚润东，刘宇璇，杨国庆，李 璐，施 磊，靳永胜

(1.北京市城市管理研究院，北京 100028； 2.北京农学院 生物科学与工程学院，北京102206)

2011年,北京市生活垃圾总量达634.9万t,日产量约1.74万t[1]，2015年,垃圾产生量已经达到790.33万t[2]。在多数发展和发展中国家，处理垃圾的主要手段是垃圾填埋[3]，垃圾在填埋的过程中，会产生大量的垃圾渗滤液，目前中国的垃圾渗滤液产量已经达到每年3 000万t以上[4]，而1 t渗滤液约相当于100 t城市污水所含污染物的浓度[5]。氨氮、TN、COD是垃圾渗滤液的主要污染物。Loukidou[6]等采用移动床生物滤池处理渗滤液，氨氮的去除率达85%，Lo[7]等采用SBR的方式处理垃圾渗滤液，氨氮的去除率达99%。但是这些研究只是实现了氨氮的去除，渗滤液中的TN仍然很高。王凯等[4]认为如果通过生化工艺可以直接实现渗滤液TN的高效去除，会极大地降低处理成本。尹文俊等[8]认为利用生化法实现垃圾渗滤液的深度脱氮，是未来垃圾渗滤液处理技术的发展方向。因此筛选出能高效降解渗滤液中氨氮或TN的菌株，对垃圾渗滤液处理生化工艺中TN的高效去除具有重要意义。

此研究在高浓度的初始氨氮浓度条件下从北京市某垃圾填埋厂渗滤液中筛选出一株能高效降解氨氮的菌株SDB1-2，并对其进行了氨氮浓度的耐性实验及在实验室条件下对实际垃圾渗滤液处理效果的研究，旨在为开发垃圾渗滤液处理生化工艺中氨氮、TN或COD的高效去除提供理论依据和技术支持。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 垃圾渗滤液来源 筛选出的优势菌株所用的渗滤液来源于北京市南宫堆肥厂。对渗滤液应用研究中所用垃圾渗滤液从北京市某垃圾综合处理填埋场获得，检测该垃圾渗滤液氨氮含量1 034 mg/L，总N含量1 216 mg/L,COD 22 000 mg/L。

氨氮的测定方法：纳氏试剂分光光度法。总N的测定方法：过硫酸钾双波长分光光度法。COD的测定方法:德国WTW公司COD试剂盒1.14541检测。

1.1.2 培养基 富集培养基：(NH4)2SO49.44 g，FeSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.25 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g， C6H5O7Na3·2H2O 39.0 g，微量元素1 mL, dH2O 1 000 mL，调pH值6.8。

筛选培养基：(NH4)2SO49.44 g，FeSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41g，KH2PO40.25 g/L ,MgSO4·7H2O 0.5 g，C6H12O610.0 g，微量元素1 mL, dH2O 1 000 mL，调pH值6.8。

分离培养基：富集培养基中加入20%琼脂。

1.1.3 主要仪器和药品 主要仪器有上海仪电分析仪器有限公司生产的752N型紫外可见分光光度计、BIO-RADPCR反应扩增仪、上海精密科学仪器有限公司生产的型号FA1004N的万分之一天平,上海精宏实验设备有限公司型号LHZ-111落地式恒温振荡器，北京金利顺腾科技有限公司型号YT-CJ-1ND超净工作台，天津taisite电热恒温培养箱等。主要药品:氯化铵、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水合硫酸亚铁，七水合硫酸镁、蔗糖、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、过硫酸钾均购自国药集团化学试剂有限公司，那氏试剂购自天津久木科技有限公司，所用试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分离纯化和筛选 取渗滤液5 mL，加入到灭菌后的100 mL富集培养基中，恒温震荡培养(30 ℃，180 r/min)，连续富集5 d，用稀释涂布平板法以10-4、10-5、10-6三个梯度分别涂布于分离培养基，30 ℃恒温倒置培养。用接种针挑出所有单菌落，以三线法在分离培养基上纯化5到6次，直致纯化出单一菌落，对筛选出的菌株进行编号，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 降解氨氮菌株的初步筛选 把纯化后的单菌落分别接种到100 mL经121 ℃、灭菌20 min的筛选培养基中，并设CK，每隔24 h检测1次培养基中的氨氮，连续检测5次，计算氨氮降解率。氨氮降解率(%)=(CCK-C样品)/Cck×100。式中：C，氨氮含量(mg/L)。

1.2.3 菌株的形态特征及分子鉴定 挑取SDB1-2单菌落以三线法接种于分离平板上，30 ℃恒温培养24 h，挑取单菌落于20 μL无菌dd H2O中，混匀，以其为模版用细菌扩增的通用引物27f和1492r扩增其16s rRNA基因序列，扩增之后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带大小约1 500 bp，将扩增成功的PCR产物送到北京博迈德基因技术公司测序，测序结果回来之后在NCBI上进行序列比对，并用MEGA 5.0做相似性分析。

1.2.4 不同初始氨氮浓度设置 氨氮初始浓度分别为100、500、750、1 000、2 000 mg/L，共5个条件；C/N比为10；C源为蔗糖；不调pH值，接种量1%，每个条件设2个重复，1个CK，每隔24 h检测1次培养基中的氨氮，连续检测5次，计算氨氮降解率。

1.2.5 SDB1-2菌株对渗滤液的处理 对渗滤液分别设121 ℃、灭菌20 min和不灭菌，每个条件设3个平行样，以不接菌渗滤液为CK，设2个对照，不调pH。

具体操作如下，用接种环挑取SDB1-2单菌落接种到装有100 mL筛选培养基中，置于28 ℃、120 r/min 摇床中培养24 h，以1%的比例接种到装有100 mL垃圾渗滤液的三角瓶中，同CK一起，置于28 ℃、120 r/min 摇床培养，每隔24 h检测1次渗滤液中氨氮、总氮、COD，连续检测5次。分别计算氨氮、TN、COD降解率。TN降解率(%)=(CCK-C样品)/Cck×100。式中：C，TN含量(mg/L)；COD降解率(%)=(CCK-C样品)/Cck×100。式中：C，COD含量(mg/L)。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征及分子鉴定

2.1.1 菌株的形态特征 SDB1-2培养后单菌落个体较大，菌落灰白色，湿润黏稠，边缘规则，突起生长，正反面颜色相同。在显微镜下观察菌体细胞短杆状，革兰氏染色阴性(图1)。

2.1.2 分子鉴定结果 SDB1-2菌株全长1 445 bp，把测序结果在http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行序列比对，并用MEGA 5.0做相似性分析(如图1)，发现该菌株的基因序列与已登记Klebsiellapneumoniae( JN644536.1)肺炎克雷伯氏菌，序列同源性最高。因而确定该菌株为肺炎克雷伯氏菌属。将筛选得到的SDB1-2菌株命名为肺炎克雷伯氏菌CitrobacterfreundiiSDB1-2,简称SDB1-2。

图1 SDB1-2光学显微镜图(革兰氏染色)和系统发育树Fig.1 Optical micrographs and Phylogenetic tree of SDB1-2

2.2 高效降解氨氮菌株的初步筛选

由图2可知，该标准曲线R2为0.999，方程式为，y=0.186x+0.001，根据该标准曲线计算待测样品中氨氮的含量，进而计算菌株对氨氮的降解率。筛选出7株菌株5 d内对氨氮的降解率分别为SDB1-1(16.55%)、SDB1-2(39.03%)、SDB1-3(32.32%)、SXT1-1(22.89%)、SXT1-2 (10.92%)、SXT1 (7.05%)、SXT1 (40.07%)。选取SDB1-2为本研究的试验菌株。

图2 氨氮(NH4+-N)标准曲线Fig.2 Ammonia nitrogen concentration standard curve

2.3 SDB1-2菌株对不同初始浓度氨氮的去除

如图3所示，该菌株对高浓度的氨氮适应能力较强，当初始氨氮浓度为100～1 000 mg/L时，其均能对氨氮进行高效去除，在初始氨氮100 mg/L浓度下，24 h后氨氮去除率为100%；当氨氮初始浓度提高到500 mg/L时48 h的去除率为89.02%，72 h的去除率为92.54%；当氨氮初始浓度提高到750 mg/L时，其5 d内最高去除率为82.18%，当初始氨氮浓度高达2 000 mg/L时，仍能对氨氮进行有效去除，5 d内氨氮最高去除率为37.37%。表明该菌株能适应高浓度的氨氮。不同的氨氧化菌对氨氮浓度的耐受程度不同，2006年Kim[9]和Joo[10]的研究均表明，高浓度氨氮会抑制氨氮降解菌及其他细菌的生长，影响氨氧化菌的活性进而影响微生物对氨氮的去除，因此筛选出具有高效氨氮耐受性的菌株对实际应用具有重要的意义。

图3 氨氮初始浓度对菌株SDB1-2氨氮去除率的影响Fig.3 Effect of the initial concentrate on of NH4+-N on ammonia degradation on rate of strain SDB1-2

2.4 SDB1-2菌株对渗滤液的应用

由图4可知，把菌株SDB1-2以1%的比例接入原始渗滤液中，5 d对该渗滤液中氨氮的去除率仅为21.13%，把菌株SDB1-2以1%的比例接入到无菌渗滤液中，其对氨氮的去除率显著提高，5 d对该渗滤液中氨氮的去除率为51.15%；图4可以看出5 d对该渗滤液中TN的去除率为20.06%，把菌株SDB1-2以1%的比例接入到无菌渗滤液中，其对TN的去除也有所提高，5 d对该渗滤液中总氮的去除率提高到35.03%；图4显示菌株SDB1-2对原始渗滤液中的COD去除仅为5.47%，但对无菌渗滤液经过高温高压处理后，同等条件下其去除率提高到了57.45%。

图4 菌株SDB1-2对渗滤液中氨氮和TN以及COD去除率的影响Fig.4 Effect of strain SDB1-2 on ammonia nitrogen，TN，COD removal rate in leachate

3 结论与讨论

垃圾渗滤液是一种高浓度的有机废水，具有水质复杂，微生物种类繁多，有机物、氨氮、TN和COD含量高等特点，单一的处理工艺很难使处理后的渗滤液达到直接排放的标准，生化联合物化的方法是目前垃圾渗滤液处理研究的热点。本文作者在高浓度的初始氨氮浓度条件下从北京市南宫堆肥厂垃圾渗滤液中筛选出一株能高效降解氨氮的菌株SDB1-2，该菌株最高能耐受初始氨氮浓度为2 000 mg/L的人造废水，在不添加任何其他物质的条件下，该菌株对实际垃圾渗滤液中氨氮、TN和COD均能实现一定程度的降解，对同一批渗滤液进行高温高压处理后，同等条件下其对渗滤液中氨氮、TN和COD的降解显著提高。一是垃圾渗滤液中成分复杂，有机物含量高等特性，抑制了菌株的生长，进而影响了其对渗滤液中氨氮、TN和COD的降解效果，经过高温高压后其中有机物等成分发生变化，正是这些变化促进了菌株SDB1-2的生长，以及其对渗滤液中污染物的去除。二是垃圾渗滤液除了含有氨氮、COD，有机物等，其中的微生物种类和含量也很丰富，苏月[11]等对北京市大屯垃圾转运站垃圾压缩原液中细菌、真菌和古菌的群落结构进行分析，结果表明，细菌包括22个门，357个属，真菌包括4个门，67个属，古菌有3个门，35个属；吴双[12]等对北京市北神树生活垃圾填埋场细菌群落结构和分布进了分析表明，其中2-15年的垃圾，细菌群落种类多样，但是降解功能丰富的菌群丰度较低。这些种类繁多的微生物菌群，在一定程度上抑制了菌株SDB1-2的生长，当对垃圾渗滤液进行高温高压灭菌后，其中微生物群落灭亡，反而促进了菌株SDB1-2的生长，进而促进了菌株SDB1-2对渗滤液中污染物的去除。其真正的原理还有待进一步的研究。