表皮生长因子对乳腺癌细胞上皮-间质转化的影响及钙蛋白酶的介导作用*

金 爱， 王宏键， 王旭东*

(贵州医科大学 基础医学院 生理学教研室， 贵州 贵阳 550025)

乳腺癌是女性最常见的激素依赖性恶性肿瘤，严重威胁女性的身心健康[1-2]。表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽,可与靶细胞上的EGF受体特异性识别，最终促进靶细胞DNA合成及有丝分裂[3-4]。以往研究证明，EGF可诱导乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞发生上皮间质转化(EMT)[5-6]，EMT作为一种生物学过程，可使上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型的细胞[5-6]，还可使上皮来源的恶性肿瘤获得迁移和侵袭能力[7-8]，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力是增强乳腺癌转移的必要条件[9]，提示有效抑制EMT可能是遏制乳腺癌转移的关键。本课题组前期工作显示，EGF可通过Calpain诱导乳腺癌MCF-7细胞迁移[10]，但Calpain是否参与EGF诱导的EMT还未见文献报道，本研究主要对此进行探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验材料和试剂 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7(中国科学院上海细胞库)，DMEM培养基、RPMI-1640培养基、抗生素(penicillin and streptomycin，美国Hyclone 公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，EGF(美国Peprotech)，Calpeptin(美国sigma公司)，抗FN多克隆抗体(美国abcam公司)，羊抗小鼠IgG-HRP，羊抗小兔IgG-HRP购自美国Santa Cruz公司，抗E-cadherin多克隆抗体、抗GAPDH多克隆抗体(南京Bioworld公司)，蛋白浓度测试试剂盒(上海碧云天公司)。

1.1.2实验仪器 Model 310恒温CO2培养箱购自美国Thermo公司，SW-CJ-2FD超净工作台购自苏州净化，MiniVE电泳设备购自美国GE公司，CKX41倒置显微镜购自日本Olympus公司，凝胶成像系统购自美国SynGene公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 MCF-7细胞培养于10% FBS、1% 抗生素、89% RPMI-1640培养基中，MDA-MB-231乳腺癌细胞培养于10% FBS、1% 抗生素、89% DMEM培养基中。细胞培养于培养箱中，培养条件为37 ℃、5% CO2及饱和湿度。

1.2.2药物处理 取对数期细胞传代于6孔板或12孔板中，当细胞密度达到60%～90%时，更换成不含血清的RPMI-1640或DMEM培养基同步化24 h，当细胞生长至所需实验密度时，加EGF(50 μg/L)处理或加入Calpeptin(10 μmol/L)预处理4 h后用EGF处理。

1.2.3划痕实验检测细胞迁移能力 将生长状态良好的模型细胞铺于12孔板中，培养细胞至90%～100%密度后，更换无血清培养基继续培养细胞24 h，用200 μL枪头在12孔板皿底作“十字”划痕，以PBS清洗掉漂浮细胞。加EGF处理或加入Calpeptin预处理4 h后用EGF处理模型细胞。分别在0 h、24 h和48 h时在标记区域进行拍照记录，统计细胞划痕区域宽度，计算细胞迁移率，细胞迁移率=[(0 h划痕宽度-24 h/48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度]×100%。

1.2.4蛋白印记实验检测模型细胞FN和E-cadherin表达变化 消化模型细胞并铺于6孔板，次日更换无血清培养基同步化24 h，待细胞汇合度达70%，加EGF处理或加入Calpeptin预处理4 h后用EGF处理模型细胞，于处理结束后提取蛋白，配制含1 mmol/L蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液并于冰盒中裂解20 min，于4 ℃离心机中以12 000 r/min离心15 min，吸取上清液至标记好的EP管中，立即进行蛋白定量。10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白(30 μg/泳道)，湿转法将分离的蛋白转印至硝酸纤维膜。5%牛血清白蛋白室温封闭1～2 h，TBST洗膜3次/10 min，然后按要求加入抗FN多克隆抗体(1∶1 000)、抗E-cadherin多克隆抗体 (1∶1 000)室温孵育2 h。TBST洗膜3次/10 min，加入相应二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，用凝胶成像仪进行成像拍照。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 EGF促进模型细胞迁移

EGF处理24 h和48 h时均能显著促进模型细胞迁移。与对照组比较，EGF组MCF-7细胞24 h时迁移率增加(149.2±10.1)%，48 h时迁移率增加(246.7±14.6)%，差异有统计学意义(P<0.01)；与对照组比较，EGF组MDA-MB-231细胞24 h时迁移增加(55.0±4.3)%，48 h时迁移率增加(90.9±8.5)%，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

(1)与对照组比较， P<0.01图1 EGF不同诱导时间两种乳腺癌模型细胞迁移Fig.1 Migration of two breast cancer models induced by EGF at different time

2.2 EGF诱导模型细胞E-cadherin表达下调和FN表达上调

EGF处理24 h、48h和72 h时均能诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞FN表达上调和E-cadherin(E-cad)表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)，其中在48 h时EGF显示具有最佳诱导效应，见图2。

2.3 Calpeptin抑制EGF诱导的模型细胞迁移

Calpeptin(10 μmol/L)预处理能显著抑制EGF诱导的模型细胞迁移。与EGF组相比，EGF+Calpeptin组MCF-7细胞24 h时迁移降低(88.2±7.6)%，48 h时迁移率降低(68.3±5.2)%，差异有统计学意义(P<0.01)；与EGF组比较，EGF+Calpeptin组MDA-MB-231细胞24 h时迁移率降低(29.1±2.5)%，48 h时迁移率增加(39.6±3.5)%，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

2.4 Calpeptin抑制EGF诱导的模型细胞E-cadherin表达下调和FN表达上调

Calpeptin预处理EGF处理模型细胞48 h时，显著抑制EGF诱导的MCF-7和MDA-MB-231细胞FN表达上调和E-cad表达下调，有统计学意义(P<0.01)，见图4。

3 讨论

众所周知，乳腺癌患者死亡的主要原因是肿瘤细胞远位转移[11]。而肿瘤细胞转移涉及多个生物学过程，包括原发肿瘤细胞脱落、迁移、侵袭、黏附及血管生成等[12]。已有大量研究报道乳腺癌细胞EMT伴随迁移和侵袭活动增强[13-14]。临床研究显示，EMT标志物E-cadherin和波形蛋白与乳腺癌淋巴转移存在明显相关性[15]。提示EMT是引起乳腺癌迁移、侵袭及转移的关键生物学行为之一。本课题组前期工作显示， EGF可促进ER阳性的MCF-7细胞迁移[10]。而本研究结果发现，EGF不仅能诱导ER阳性的MCF-7细胞迁移，同时在ER阴性的MDA-MB-231细胞中也发挥类似诱导效应。进一步实验发现，EGF能显著诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞FN蛋白表达上调和E-cadherin蛋白表达下调。而FN表达上调和E-cadherin的减少或丢失被认为是EMT的重要标志[16]。提示EGF可诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞EMT。本课题组前期工作报道，Calpain抑制剂预处理可抑制EGF诱导的MCF-7细胞迁移[10]。而本研究在MCF-7和MDA-MB-231细胞中也观察到了相类似的现象。为观察Calpain是否参与EGF诱导的模型细胞EMT，本研究进一步观察了Calpain特异性抑制剂Calpeptin的抑制效应。结果显示，Calpeptin可显著抑制EGF诱导的FN蛋白表达上调和E-cadherin蛋白表达下调。提示，抑制Calpain可抑制EGF诱导的MCF-7和MDA-MB-231细胞EMT。

(1)与0 h时比较， P<0.01图2 EGF不同诱导时间对两种乳腺癌细胞中FN和E-cad蛋白水平表达的影响Fig.2 Effects of EGF on the expression of FN and E-cad protein levels

(1)与EGF组比较，P<0.01图3 Calpeptin抑制EGF不同诱导时间的乳腺癌细胞迁移Fig.3 Calpeptin inhibits the migration of breast cancer cells induced by EGF

(1)与EGF组比较， P<0.01图4 Calpeptin预处理抑制EGF对两种乳腺癌细胞E-cadherin和FN表达的诱导Fig.4 Calpeptin pretreatment inhibits EGF-induced expression of E-cadherin and FN in model cells

综上所述，EGF能诱导ER阳性乳腺癌MCF-7和ER阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT和迁移，而本研究首次发现上述效应可能与Calpain的介导作用相关。大量证据表明Calpain与包括乳腺癌在内的多种癌症的发生有关，如参与肿瘤转移和细胞增殖[17-18]。因此，干预Calpain可能有助于遏制EGF的促癌作用。Calpain包括多种亚型分子，广泛表达的Calpain分为μ-钙蛋白酶(Calpain1)和m-钙蛋白酶(Calpain2)[19]。本研究下一步实验将会重点探讨Calpain1和Calpain2在上述生物学行为中的作用，为临床乳腺癌治疗提供理论依据。