O-GlcNAc糖基化修饰诱导髓核细胞自噬作用机制的体外实验*

孙鹏霄， 胡洪波， 李 政， 李玉民

(渭南市中心医院 骨外科， 陕西 渭南 714000)

椎间盘退化性病变(intervertebral disc degeneration，IVD)是造成下腰痛的主要原因，其病理机制是衰老的髓核(nucleus pulpous，NP)细胞凋亡促进炎性细胞因子的分泌、细胞内免疫细胞的聚集以及细胞外基质的数量减少，同时增加的降解酶会进一步消化细胞外基质组织、合成不足的细胞外基质发生结构变化容易导致椎间盘的异常负荷，从而进一步导致细胞外基质分解，最终导致椎间盘结构破坏。研究表明，衰老组织中调节OGA糖基化的酶表达增加，细胞在受到诱导凋亡时，Bcl-2和Bax基因在细胞存活或者死亡中发挥重要作用[1]；此外，Caspase-3在细胞凋亡的终末途径中也有重要作用，降低Caspase-3的活性，具有抗凋亡的作用[2-4]。若抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达，增强抗凋亡蛋白Bcl-2表达，则可以通过调节细胞促凋亡和抗凋亡信号通路平衡，保护细胞。细胞受到损害时，自噬(autophagy)途径会被激活，自噬信号通路的激活可以起到细胞保护作用[5-7]。若上调自噬蛋白Beclin-1和Lc3B/Lc3A的比值，则可保护细胞，即可通过自噬的自我修复程序降低细胞损伤。而Bax是与Bcl-2同源的水溶性相关蛋白，是BCL-2基因家族中细胞凋亡促进基因，Bax的过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于死亡。关于能否通过调节NP细胞的OGA来增加NP细胞的保护性自噬，防治衰老诱导的细胞凋亡和椎间盘退行性变的研究尚未见报道。本研究拟通过调节NP细胞O-GlcNAc糖基化修饰、观察其对自噬作用调节，以期为椎间盘退行性变的治疗指明新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 实验选用健康、清洁级成年雄性SD大鼠，体质量250～300 g，符合国家二级实验动物标准，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.1.2主要试剂 DMEM液体培养基购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自美国GIBCO公司，Ⅱ型胶原酶及胰蛋白酶C购自美国Sigma公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国HyClone公司，单丹磺酰戊二胺(MDC)购自美国Sigma公司，自噬抑制剂购自美国3-MA

1.2 方法

1.2.1大鼠NP细胞的分离和培养 选取12周龄、健康雄性SD大鼠，腹腔注射5%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，肌注阿托品0.04 mg，待大鼠翻正反射及角膜反射消失，将其俯卧位固定、无菌条件下截取SD大鼠胸腰段脊柱组织，在无菌超净台提取大鼠椎间盘髓核组织。将髓核组织用组织剪剪碎后加入0.25% Ⅱ型胶原酶消化5 min，采用200目过滤网过滤，收集细胞过滤液进行离心(1 000 g，5 min)，使用含有15%胎牛血清的DMEM-F 12细胞培养液悬浮NP细胞，存放于浓度为5%的CO2、95% O2的培养箱中培养7 d，每2 d更换培养液1次，倒置显微镜观察NP细胞形态学变化，取第二代SD大鼠NP细胞用于后续实验。

1.2.2分组 第二代SD大鼠胸腰段椎间盘NP细胞分为对照组和实验组,对照组为经过压力培养的第二代SD大鼠NP细胞；实验组经过压力培养的NP细胞分别选用氧联乙酰葡萄糖胺转移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和氧联乙酰葡萄糖胺水解酶(O-GlcNAcase,OGA)进行干预，再分为OGT组和OGA组。

1.2.3步骤 将生长状况优良的第二代SD大鼠胸腰段椎间盘NP细胞分别接种至24孔板，加0.5 mL培养基，细胞接种密度为1.5×106/cm2，存放于浓度为5%的CO2、95% O2的培养箱中，在37 ℃条件下培养过夜，NP细胞完全贴壁后将NP细胞培养板置入压力培养装置中，设为对照组；实验组中OGT组为在压力条件下NP细胞培养液内加入O-GlcNAc 促进剂OGT，OGA组加入O-GlcNAc 抑制剂OGA。各组大鼠NP细胞压力条件下培养时间分别为0 h、12 h、 24 h、36 h及48 h，每个时间点处取出24孔细胞培养板，吸出培养皿中培养基，用温PBS洗涤2次，将浓度0.06 mmol/L MDC 100微升加入24孔板，避光37 ℃条件下孵育20 min，然后用温PBS洗涤3次。采用流式细胞技术进一步定量分析NP细胞出现自噬空泡细胞的比率及阳性细胞的比例以及NP细胞发生凋亡的比例，并分析在OGT/OGA作用下细胞存活比例。在0 h、12 h、 24 h、36 h及48 h各时间点，采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)对NP细胞自噬和凋亡相关基因的表达进行检测。通过提取各组NP细胞mRNA分别检测自噬相关基因LC3B、Beclin-1的表达情况和凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 阳性细胞比例

在1 MPa压力条件培养下于各时间点进行观察，可见第二代SD大鼠胸腰段NP细胞内随着培养时间的延续，大鼠NP细胞中自噬空泡数量逐渐增加。流式细胞计数结果显示，对照组和OGA组SD大鼠NP细胞内阳性细胞随着培养时间延续，自噬空泡阳性细胞数目逐渐增加，至36 h时达到峰值、48 h后有所减少；与对照组比较，OGA组24 h、36 h及48 h时的阳性细胞比例显著升高(P<0.05)。见图1。

(1)与Control组同时点比较，P<0.05图1 OGA组和对照组第二代SD大鼠胸腰段椎间盘NP细胞自噬空泡细胞比例 Fig.1 The effect of OGA on the percentage of autophagic vacuolar positive cells

2.2 凋亡细胞比例

在1 MPa压力条件培养下于各时间点进行观察，可见第二代SD大鼠NP细胞内随着培养时间的延续，大鼠NP细胞中凋亡细胞所占比例逐渐增加。流式细胞计数结果显示，对照组和OGA组SD大鼠NP细胞内凋亡细胞随着培养时间延续数目逐渐增加，至48 h时达到峰值。与对照组比较，OGA组24 h、36 h及48 h时的凋亡细胞比例显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 在1 MPa压力培养条件下SD大鼠胸腰段椎间盘NP细胞凋亡情况Tab.1 Quantitative analysis of of NP cellular apoptosis under pressure culture

2.3 SD大鼠存活的NP细胞

在1 MPa压力条件培养下于各时间点进行观察，可见第二代SD大鼠胸腰段椎间盘NP细胞随着培养时间的延续， NP细胞存活比例逐渐下降；流式细胞计数结果显示，对照组和OGA组NP细胞存活细胞数目逐渐减少，OGA组24 h、36 h及48 h时的存活的NP细胞比例显著高于对照组(P<0.05)。

2.4 NP细胞中Bcl-2、Bax、Caspas-3、LC3B 及Beclin-1 mRNA表达

在1MPa压力条件培养下于各时间点进行实时荧光定量PCR测定OGA组与对照组NP细胞凋亡相关基因表达情况，可见第二代SD大鼠NP细胞内随着培养时间的延续，大鼠NP细胞中Bcl-2基因的表达逐渐减少，Caspase-3及BaxmRNA的表达逐渐增多；OGA组与对照组各个时间点比较细胞凋亡相关Bcl-2 mRNA的表达减少幅度显著，Caspase-3及BaxmRNA的表达增加的幅度显著，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。在1 MPa压力条件培养下于各时间点进行实时荧光定量PCR测定OGT组与对照组NP细胞自噬相关基因表达情况，可见第二代SD大鼠NP细胞内随着培养时间的延续，大鼠NP细胞中LC3B与Beclin-1 mRNA的表达逐渐增加(P<0.05)，至36 h时达至峰值，48 h时降低，在12 h及之后各时间点OGT组表达情况均显著高于对照组(P<0.05)，见表3。

表2 在1 MPa压力培养条件下SD大鼠胸腰段椎间盘NP细胞存活比例Tab.2 The survival rates of NP cells under pressure culture

表3 大鼠NP细胞中Bcl-2、Bax、Caspas-3、LC3B 及Beclin-1基因表达Tab.3 The mRNA levels of Bcl-2, Bax, Caspas-3, LC3B and Beclin-1

3 讨论

IVD是发生在脊柱的肌肉骨骼疾病，会造成腰背部疼痛和身体残疾，导致个人生活困难和经济损失。据调查，椎间盘退变好发于18～64岁，亦是此类人群去医院就诊的最常见的原因。在欧美国家，与IVD相关的社会经济损失估计每年在美国达850亿美元，在英国更达到120亿英镑[8-9]。椎间盘位于相邻的两片软骨终板之间, 以中央的NP细胞及周围的纤维环(annulus fibrosus，AF)为主要构造。NP细胞为凝胶状,具有类似减震器的功能，可以将压力自内向外往周围的纤维环和相邻椎体间释放分数。NP主要是由Ⅱ型胶原蛋白和弹性蛋白纤维结构而成的一个不规则的网络, 这网络可以将蛋白多糖基质和水分子拢聚在一起。NP内的主要蛋白多糖成分是蛋白聚糖聚合物，这种分子中含有大量的阴离子糖胺聚糖的侧链，这使得NP得以吸收大量水份从而抵消压缩载荷。而纤维环AF由约20个同心环(片)的高度组织化I型胶原纤维组成，这使其具有最大的拉伸强度。椎间盘也包含其他胶原、蛋白多糖及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，其可给位于NP和AF的细胞提供各种物理和生化信号[10-11]。 NP的细胞外基质成分包括弹性蛋白(elastin)、小分子蛋白多糖及III、VI、IX型胶原和层粘连蛋白[12]，其中某些分子(如VI型胶原蛋白和n-钙黏着蛋白)可通过NP细胞表面受体与NP细胞相互作用。另外，这些细胞外基质成分还能通过调节营养物质的运输、水化和膨胀压力等方式以机械性方式作用于NP细胞。这些作用被认为对椎间盘的发展、功能维持、自我修复等过程相当重要，然而，研究人员对这些详细机制仍知之甚少。研究者普遍认为椎间盘退化性病变是ECM过度代谢的后果。细胞外基质中大分子的降解会导致细胞外基质的结构和成分发生变化。在椎间盘退化性病变的过程中，NP和AF区域的细胞密度和细胞集群数量会急剧减少[13]。随着细胞密度的减小，NP区域的巨大空泡状胞浆细胞会转变为一群体积小﹑数目少且独立分布的软骨样细胞[14]。同时，ECM中蛋白多糖基质丢失还能引起ECM结构的变化，从而降低固定负电荷密度和水分含量，导致膨胀压力的丧失[15]。 NP区域发生的这些变化将导致AF承受异常负荷，因而导致ECM发生进一步分解，最终导致椎间盘结构破坏。NP细胞是软骨细胞特异性细胞外基质的重要来源。研究表明椎间盘退化性病变起始于NP区域, NP细胞的过度凋亡是椎间盘退化性病变过程中最重要的结构和生化变化[16-17]。过度凋亡可造成NP细胞数量减少，并导致ECM的合成减少。 ECM分泌不足最终引发椎间盘退化性病变。因此，预防NP细胞凋亡被认为是减少ECM降解﹑延缓椎间盘退化性病变的最新研究焦点，亦是治疗的潜力新途径。

自噬是一种降解过程, 过程中部分细胞胞浆与溶酶体双膜囊泡融合形成自噬性溶酶体。这是一种细胞自我保护过程:细胞质通过胞质大分子降解提供富含能量的化合物来进行自我更新，以在外部或内部资源日益减少时满足细胞的能量需求。这一过程同时也可帮助清除老旧蛋白或受损的蛋白和胞器，即通过回收胞质成分来保持蛋白质和细胞器的质量。因此，自噬在细胞的生长、存活、分化和代谢中起着重要的作用，是细胞一种主要的自我保护作用而不是自我毁灭的过程[18-19]。细胞凋亡和自噬在人体的发育、生理以及疾病的发生发展中都很重要。最近的研究表明，尽管凋亡和自噬间有显着差异，但它们的调节却是密切相关的，而且共享相同的调控机制，因此凋亡和自噬可以互相调节。例如，细胞自噬伴随着Bcl-2从Beclin1的释放，以及FLIP从Atg3的释放，而自由态的Bcl-2和FLIP可阻止细胞凋亡[20-21]。从生理的角度来看，自噬对决定细胞死亡是相当重要的，可以通过防止不必要的细胞凋亡来保护细胞[22]。

本研究结果显示，OGA作为O-GlcNAc 抑制剂能够通过抑制O-GlcNAc 糖基化修饰过程来促进NP细胞自噬过程的发生，进而对NP细胞凋亡过程发挥抑制作用。GA作为O-GlcNAc 抑制剂能够通过抑制O-GlcNAc 糖基化修饰过程来促进NP细胞自噬过程的发生，进而对NP细胞凋亡过程发挥抑制作用。OGA作为O-GlcNAc 抑制剂能够通过抑制O-GlcNAc 糖基化修饰过程来促进NP细胞自噬过程的发生，进而对NP细胞凋亡过程发挥抑制作用，增加NP细胞存活的比例。除了细胞凋亡的调控，自噬也参与调节炎症反应。据报道，自噬反应缺陷的Atg16l1基因敲除小鼠对LPS刺激的炎症反应显著高于正常对照, 包括caspase1的过度激活和IL-1β的大幅增加[23]。在衰老的过程中，自噬相关基因包括LC3、Beclin1和ULK1在不同的组织中均下调，提示这些组织中自噬作用的减少[24-25]。同时，椎间盘退化性病变过程中自发产生的炎症细胞因子增加，这将进一步导致更多的炎性介质释放并促进椎间盘退化性病变发展[26]。理论上若提高自噬水平应可阻止细胞凋亡和炎症反应的发生。最近，O-GlcNAc糖基化做为蛋白质糖基化修饰的一种形式，也被证明可以调节自噬。O-GlcNAc糖基化是将单糖分子N-乙酰葡糖胺通过β-糖苷键添加到细胞核或细胞质多肽上的丝氨酸或苏氨酸残基的一种糖基化过程。 O-GlcNAc的添加是由N-乙酰葡萄糖胺转移酶催化；而移除则是由 N-乙酰基葡萄糖苷酶催化去除。由于O-GlcNAc糖基化的丝氨酸/苏氨酸残基往往与蛋白激酶磷酸化修饰位点是重复或接近的，所以O-GlcNAc糖基化往往可以通过与蛋白激酶相互作用参与多种细胞途径和功能调节[27]。如同磷酸化过程一样，借着OGA/OGT的调控，O-GlcNAc糖基化与蛋白质磷酸化修饰相互作用，参与许多细胞调控过程。本研究还表明，O-GlcNAc糖基化参与调节自噬反应。因此，通过调控O-GlcNAc糖基化来调节NP细胞自噬以影响椎间盘退化性病变成为一个相当有潜力的研究焦点。