2545例新生儿遗传性耳聋基因突变筛查

马宁 ，王艳 ，彭薇 ，李昊 ，杨晓

1.中国人民解放军总医院第七医学中心八一儿童医院，北京市100700；2.出生缺陷防控关键技术国家工程实验室，北京市100700；3.儿童器官功能衰竭北京市重点实验室，北京市100700

耳聋是常见的感觉功能障碍，也是常见的致残疾病。据世界卫生组织估计，2005年全球听力残疾人约2.78亿。全国第二次残疾人抽样调查显示，我国目前约有2780万听力残疾人，约占残疾人群的33.5%[1]。由于人口基数巨大，每年大概新增6万~8万耳聋人口，中国耳聋发病率约1‰~3‰[2-3]。

耳聋的成因大致分为两类：遗传因素和环境因素，遗传因素是耳聋的主因。遗传性耳聋分为常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传、线粒体遗传(母系遗传)和性染色体遗传等，临床上按其表现分为综合征性耳聋和非综合征性耳聋[4]，其中以非综合征性耳聋为主，目前发现非综合征性耳聋最常见的致聋基因是GJB2、SLC26A4、12S rRNA和GJB3[5-7]。

新生儿听力筛查是常规听力筛查措施，但难以有效发现迟发性耳聋、药物性耳聋和高频听力耳聋。针对非综合征性耳聋进行基因筛查，可以从分子生物学层面发现耳聋病因，真正做到早发现和早治疗，采取有针对性的治疗方案。全国已经有多地开展新生儿常见耳聋基因突变筛查[8-12]。由于区域遗传背景和地域隔离等因素影响，区域基因突变的携带率和突变谱各不相同。通过大规模基因筛查，可以了解区域耳聋基因致病位点的分布和发病情况，建立科学的预测模型，为耳聋防控提供数据支持。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2018年1月至10月在中国人民解放军总医院第七医学中心八一儿童医院出生的新生儿2545例足跟血样本，于2018年11月至12月，在八一儿童医院发育生物学实验室进行十五项遗传性耳聋基因检测。

本研究已获得中国人民解放军总医院第七医学中心伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器设备

干血斑基因组DNA提取试剂盒(DP334)：天根生化科技有限公司。NanQ分光光度计：博奥生物公司。十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒、SlideWasherTM24芯片洗干仪、Lux-scan 10K/B微阵列扫描仪：北京博奥晶典生物技术有限公司。ABI Veriti聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)仪：美国THERMO‐FISHER公司。

1.2.2 干血斑DNA提取

参照DP334干血斑基因组DNA提取试剂盒说明书提取样本DNA，保存于-20℃冰箱中备用。

1.2.3 PCR扩增

十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒中所涉及的15个检测位点分别分布在A、B、C三个扩增体系中。各取三个扩增体系20 μl，各加DNA 5 μl。扩增程序如下：37℃10 min，95℃15 min，95℃30 s，0.4℃/s退火至57℃30 s，0.2℃/s退火至70℃45 s，循环35次；60℃10 min，12℃∞。

2 结果

共发现119例新生儿携带耳聋基因突变，其中GJB2突变携带者60例(2.36%)，男/女比30/30，其中235和299位点突变率较高，分别为1.77%和0.55%；还发现35位点杂合突变1例。SLC26A4基因突变携带者48例(1.88%)，男/女比26/22，IVS7-2位点突变率较高(1.45%)。线粒体12S rRNA基因突变携带者5例(0.20%)，其中1555位点有2例为异质突变，需要判定其突变DNA占比。GJB3基因突变携带者5例(0.20%)。235杂合和IVS7-2杂合两个位点突变1例(0.04%)。SLC26A4基因1174A>T、1229C>T和15+5G>A杂合突变各1例。见表1。

3 讨论

遗传性耳聋以非综合征性耳聋为主，约占遗传性耳聋的70%。随着研究的深入，遗传性耳聋致聋位点被不断发现。GJB2基因目前研究比较透彻，235位点和299位点突变在人群中携带率较高[13]。高加索人群中，50%遗传性耳聋与GJB2基因有关[14]。SLC26A4基因与阴离子运输相关。SLC26A4基因突变发病相对较晚，是我国比较常见的导致功能性耳聋的基因，约占耳聋的5%~10%[15]。线粒体基因突变呈母系遗传，属于触发式耳聋，正常情况下患者听力正常，服用氨基糖苷类抗生素时可导致耳聋。线粒体基因突变约占耳聋人群的1%。

GJB2基因位于13号染色体上[16]，由两个外显子组成，但只有2号外显子参与蛋白编码，其编码产物是缝隙连接蛋白，由266个氨基酸分子组成，广泛分布于内耳螺旋韧带、基底膜等部位，在毛细胞钾离子回流过程中发挥重要作用[17]。本组新生儿GJB2基因突变频率为2.36%，与海宁市新生儿筛查结果相似[18]。GJB2基因中235delC突变频率最高，与国内的同类报道相符[8-9,19]。本次筛查中发现1例GJB2 35delG杂合突变，此位点在中国人群中突变率很低，欧美人群突变携带率较高[20-21]。发现此位点突变，可能与外来人口增加有关。

表1 新生儿耳聋基因筛查结果(n)

SLC26A4基因位于7号染色体，一般以常染色体隐性遗传，编码pendrin跨膜蛋白，主要在甲状腺和内耳表达[22]。SLC26A4基因以IVS7-2位点突变率最高[23]。该基因突变引起阴离子转运障碍，导致先天性耳聋和迟发性耳聋。迟发性耳聋新生儿听力筛查通常正常，很容易漏检。对于SLC26A4基因突变携带者要避免颅压增大和使用耳毒性药物，减少致聋发生。

本次筛查中检测到5例12S rRNA 1555位点突变，未发现1494位点突变，与国内相关研究结果相符[8-9,24]。根据母系遗传的特点，可从家庭遗传系谱推测其他成员的突变情况，减少致聋发生。值得注意的是，虽然线粒体12S rRNA属于母系遗传，但父亲也可将线粒体12S rRNA传给后代，概率约为1/5000[25]。因此，如果孩子发现有线粒体12S rRNA突变，而母亲没有发现突变，则应考虑对孩子父亲进行检测，确定突变来源。

GJB3基因位于1号染色体，属常染色体显性或隐性遗传[26]。该基因突变可导致高频听力损失或后天性耳聋。本次筛查检测出5例GJB3基因538位点杂合突变。对GJB3基因538位点突变携带者，建议其每半年行听力测试1次，时刻关注听力情况，做到早发现早治疗。

十五项遗传性耳聋筛查相对于九项遗传性筛查增加了SLC26A4基因中6个中国人群突变频率相对较高的位点，分别是1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、IVS15+5G>A，可减少遗传性耳聋漏筛的风险。本研究发现1174A>T、1229C>T和15+5G>A的杂合突变各1例，相对于九项耳聋筛查增加了突变检出率1.2个百分点。随着科学技术的发展，遗传性耳聋的筛查位点会逐渐增多，漏筛率会大大降低。

总之，本研究采用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒，对2545例新生儿GJB2、SLC26A4、12S rRNA和GJB3基因常见致聋位点进行筛查和结果统计，初步获得区域内遗传性耳聋基因突变频率和突变谱。开展遗传性耳聋基因筛查不仅能为突变患者提供专业的治疗和婚育指导，而且能有针对性地提示区域内耳聋基因防控重点，还可以进一步构建耳聋发病模型，预估区域内每年发病人数，为医院和社会救助提供数据支持。