长链非编码RNA HOST2对胰腺癌细胞增殖迁移和侵袭的影响

陈伟业，邢宏松，江帆，吴国俊，黎建军，孙权，潘德锐

（武汉科技大学附属普仁医院 1.普通外科 3.外科教研室，湖北 武汉 430081；2.武汉大学中南医院 普通外科， 湖北 武汉430071）

胰腺癌是种常见的恶性肿瘤，中位生存期仅3～6个月，5年生存率不到5%[1]。据2018年全球癌症统计，世界范围内胰腺癌在男性中发病率为5.5/10万，在女性中为4.0/10万，全年共458918例新发病例，432242例胰腺癌相关死亡[2-3]。在我国，胰腺癌占所有癌症相关死亡的4.54%[1]。由于胰腺位置较隐秘，在发现时往往已是晚期，预后不佳。寻找新的早期诊断靶标和转移靶点，对提高胰腺癌诊疗水平有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指长度超过200 nt且没有开放阅读框的RNA分子[4-5]。

人卵巢癌特异性转录体2（human ovarian cancer-specific transcript 2，HOST 2），是长链非编码RNA家族成员之一，长度约2.9 kb，没有明显的开放阅读框，被首先报道在卵巢癌中高表达[6]。lncRNA HOST2在三阴性乳腺癌[7]、肝细胞癌[8]、脑胶质瘤[9]及上皮性卵巢癌[10]中异常表达，且参与调控增殖、凋亡、侵袭和迁移等肿瘤生物学进程。然而，尚未见lncRNA HOST2在胰腺癌中的表达及功能。本研究旨在体外研究lncRNA HOST2在胰腺癌细胞系中的表达及对增殖和迁移的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常胰腺细胞系HPDE6-C7及胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3和HPAC均由华中科技大学同济医学院基础医学院实验室馈赠，vimentin、Twist1和Snail一抗均购自美国Cell Signaling公司，GAPDH一抗购自美国Santa Cruz公司，二抗购自美国Santa Cruz公司，RPMI-1640培养基购自武汉博士德生物科技有限公司，Lipofectamine™3000 Transfection Reagent购自美国Thermo Fisher公司。cDNA反转录试剂盒购自ThermoFisher公司，qRT-PCR试剂盒购自上海吉玛生物科技有限公司，荧光定量PCR仪购自美国ThermoFisher公司，lncRNA HOST2 siRNA、NT-siRNA序列均由上海吉玛生物科技有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分组将Panc-1细胞细胞系分成3组：lncRNA HOST2沉默表达 组（si-HOST2组）、阴性对照组及空白对照组，前两组采用LipofectamineTM3000分别转染lncRNA HOST2 siRNA、阴性对照siRNA[10]，空白对照组加入LipofectamineTM3000。lncRNA HOST2 siRNA序列正义链：5'-GAC UAA ACA AGG UCU UAA UTT-3'；反义链：5'-AUU AAG ACC UUG UUU AGU CTT-3',NT-siRNA序列正义链：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'；反义链：5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'，转染浓度为300 nmol/孔。

1.2.2 qRT-PCR提取3组细胞总RNA后，采用反转录法合成cDNA，GAPDH为内参，lncRNA HOST2引物序列：上游引物，5'-GGA CAG GTC CCT TGT TTC AA-3'；下游引物， 5'-CTG GTC TTT CCT TGC CTC TG-3'；GAPDH上游引物：5'-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3'；下游引物：5'-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3'。定量采用2-ΔΔCt法，GAPDH为内参，在95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，40个循环的反应条件下，测定si-HOST2组、阴性对照组及空白对照组3组样品的循环阈值，采用2-ΔΔCt法定量，计算lncRNA HOST2的相对表达量。

1.2.3 细胞增殖能力测定采用MTT法测定si-HOST2组、阴性对照组及空白对照组细胞增殖能力，将3组细胞以2×103个/孔的标准种植，培养0、24、48、72、96 h后，加入MTT 20 µL于每孔中，在450 nm波长下，采用DNM-9606酶标分析仪测定吸光度，以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，绘制增殖曲线。

1.2.4 细胞迁移能力测定细胞划痕实验用来检验细胞迁移能力：将3组细胞培养至无菌孔板后，无菌吸液枪头画融合后的细胞，观察修复时间为0、24 h，计算划痕愈合率，即=（划痕后即刻的划痕面积-划痕后24 h的划痕面积）/划痕后即刻的划痕面积×100%。实验重复3次，取均值。

1.2.5 细胞侵袭能力测定Transwell实验用来检验细胞侵袭能力：将3组细胞按每组1×104个细胞数接种于Transwell小室表面，经培养24 h后，甲醛固定穿过室膜下的细胞，染色液采用0.2%结晶紫溶液，染色后，在显微镜下（200×）计算穿膜细胞数，实验重复3次，取平均值。穿膜细胞数与侵袭能力成正比。

1.2.6 上皮-间质转化（EMT）相关蛋白Western blot检测裂解变性3组细胞，跑胶条件：浓缩胶80 V 60 min，分离胶100 V 90 min，加入vimentin、Twist1和Snail及GAPDH一抗（1:400）于4℃孵育过夜，二抗（1:1000）孵育，ECL液显影，计算灰度值，重复3次实验后取均值。

1.3 统计学处理

统计学处理采用SPSS 20.0软件处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组数据间的比较采用t检验，P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 lncRNA HOST2在胰腺癌细胞系中的表达

qRT-PCR示：人正常胰腺细胞系HPDE6-C7中lncRNA HOST2的相对表达量为1.05±0.03，胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3、HPAC中lncRNA HOST2的相对表达量分别为13.48±0.95、7.53±0.62、2.87±0.21、2.16±0.15，胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3及HPAC中lncRNA HOST2的相对表达量均明显高于HPDE6-C7细胞系（均P＜0.05）（图1）。

图1 lncRNA HOST2在不同胰腺癌细胞系及正常胰腺细胞系中的表达Figure1 The expressions of lncRNA HOST2 in different pancreaticcancer cell lines and normal pancreatic epithelial cell lines

2.2 转染效率测定

转染24h后，si-HOST2组与阴性对照组lncRNA HOST2表达量分别为0.18±0.03、1±0.06，si-HOST2组lncRNA HOST2表达量明显低于阴性对照组与空白对照组（均P＜0.01）；阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

图2 转染效率检测结果Figure2 Results of transfection efficiency

2.3 lncRNA HOST2沉默对Panc-1细胞增殖的影响

MTT实验结果显示：转染24 h以内各组OD值差异无统计学意义（P＞0.05），转染48 h后，si-HOST组OD值明显低于空白对照组与阴性对照组（均P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组在各时间点OD值差异均无统计学意义（均P＞0.05）（图3）。

图3 各组细胞增殖曲线比较Figure3 Comparison of the proliferation curves of three groups of cells

2.4 lncRNA HOST2沉默对Panc-1细胞迁移的影响

细胞划痕实验示：si-HOST2组细胞划痕愈合率为（30.5%±3.8）%，阴性对照组划痕愈合率为（64.8%±6.1）%，空白对照组划痕愈合率为（62.5±5.2）%，si-HOST2组细胞划痕愈合率明显低于阴性对照组与空白对照组（均P＜0.001）；阴性对照组与空白对照组划痕愈合率差异无统计学意义（P＞0.05）（图4）。

2.5 lncRNA HOST2沉默对Panc-1细胞侵袭能力的影响

Transwell实验示：200倍视野下，si-HOST2组侵袭细胞数为（136±25）个，阴性对照组为（381±53）个，空白对照组为（374±48）个，si-HOST2组侵袭细胞数明显少于阴性对照组与空白对照组（均P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组侵袭细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）（图5）。

图4 细胞划痕实验结果Figure4 Results of cell wound scratch assay

图5 Transwell实验结果Figure5 Results of Transwell assay

2.6 lncRNA HOST2沉默对EMT相关蛋白表达的影响

Western blot示：si-HOST2组vimentin、Twist1、Snail蛋白表达量均明显低于阴性对照组与空白对照组（均P＜0.001），而3种蛋白的表达量在空白对照组与阴性对照组间差异无统计学意义（均P＞0.05）（图6）。

图6 EMT相关蛋白Western blot检测结果Figure6 Results of Western blot analysis for EMT-associated proteins

3 讨 论

研究报道，多种LncRNA与胰腺癌发生发展相关。比如，lncRNA HOTAIR在胰腺癌组织中高表达，且与肿瘤进展相关，体外实验显示其能促进癌细胞的增殖与侵袭[11]。lncRNA MALAT1在胰腺癌中异常高表达，与肿瘤大小、分期、浸润程度及预后差相关，是影响预后的独立危险因子，体外研究显示沉默lncRNA MALAT1表达可抑制细胞周期和EMT进程[12]。其他影响胰腺癌预后的lncRNA包括lncRNA AGAP2-AS1[13]、lncRNA RP11-567G11.1[14]、lncRNA CASC2[15]等。

lncRNA HOST2是一个长度为2.9 k b的lncRNA，其在多种肿瘤中异常高表达，且与肿瘤发生发展相关[16]。在上皮性卵巢癌中，lncRNA HOST2异常高表达，抑制lncRNA HOST2表达后，卵巢癌细胞迁移、侵袭和增殖能力显著减弱[10]。在骨肉瘤中，lncRNA HOST2高表达，并可促进细胞增殖，沉默lncRNA HOST2可显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导凋亡[16]。在三阴性乳腺癌中，沉默lncRNA HOST2可抑制乳腺癌增殖[7]。在肝细胞癌中，lncRNA HOST2可促进EMT进程，通过JAK2-STAT3 信号通路影响促进增殖、迁移和侵袭[8]。在神经胶质瘤中，发现lncRNA HOST2与微小RNA let-7b呈负相关，在体外沉默lncRNA HOST2表达可抑制胶质瘤细胞系增殖、迁移和侵袭，在动物实验中可抑制克隆形成及肿瘤形成[9]。

本研究发现，相对于正常胰腺上皮细胞系HPDE6-C7，胰腺癌细胞系中lncRNA HOST2高表达，这与其它肿瘤[7-10]中的表达趋势一致，提示lncRNA HOST2在胰腺癌中可能发挥促癌基因的功能。

为进一步探讨lncRNA HOST2的功能，本研究挑选lncRNA HOST2相对表达量最高的胰腺癌细胞系Panc-1，并经转染沉默其表达，行MTT实验，发现si-HOST2组OD值显著低于阴性对照组与空白对照组，提示沉默lncRNA HOST2表达后，可显著抑制胰腺癌细胞系增殖。这与上皮性卵巢癌[10]、肝细胞癌[8]、神经胶质瘤[9]及骨肉瘤[16]中的结果一致，在吉他西滨耐药的胰腺癌细胞系中，沉默lncRNA HOST2的表达可抑制增殖并促进凋亡[17]。

EMT是一个上皮细胞转变为间质细胞的过程，在此过程中，上皮细胞间黏连减弱、失去极性并获得间质细胞特性、运动能力增强[18]。与EMT密切相关的标志物包括Snail、Twist1和vimentin等[19-20]。Snail是EMT过程中E-caherin的转录抑制因子，Snail过表达不仅可促进EMT的发生，还可增加细胞的迁移和侵袭能力[21]。Twist1是EMT诱导转录因子之一，可下调上皮表型基因如E-cadherin，上调表达间充质细胞表型基因如vimentin，进而促进肿瘤迁移和侵袭[22-23]。vimentin是一种3型中间丝蛋白，负责维持细胞形状和稳定细胞骨架，是重要的间充质细胞标志物，vimentin可调节细胞的可塑性，与肿瘤的预后差和高转移率相关[24-26]。

本研究发现lncRNA HOST2沉默后，s i-HOST2组划痕愈合率显著低于阴性对照组和空白对照组，侵袭细胞数显著低于阴性对照组和空白对照组，提示沉默lncRNA HOST2可抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭。Western blot示，si-HOST2组Snail、Twist、vimentin表达量显著低于阴性对照组和空白对照组，提示沉默lncRNA HOST2表达可能通过抑制Snail、Twist、vimentin的表达，影响EMT过程，进而抑制胰腺癌细胞迁移。

当然，由于本研究是体外实验，尚存在一定不足：首先lncRNA HOST2调控Snail、Twist1和vimentin表达的确切机制尚不完全清楚；其次lncRNA HOST2在动物体内所起的作用如何，都值得进一步研究。

综上，lncRNA HOST2在胰腺癌细胞系中异常高表达，能通过调控Snail、Twist1和vimentin表达促进胰腺癌细胞增殖和迁移能力，发挥促癌基因的功能。这提示LncRNAHOST2可能作为胰腺癌的潜在诊断和转移靶标。