经阴道彩色多普勒超声联合血清miRNA-18a和miRNA-92a 诊断宫颈癌的价值研究

孙明霞，蒋鹏程，于峰，刘彩霞，范桂莲，张辉

目前人类乳头瘤病毒（HPV）检测是宫颈癌的主要筛查方式，但其准确性不高。在宫颈癌筛查中，经阴道彩色多普勒超声（TVCDS）、血清学指标检查是常用的检查方法。但是如何将以上检查有机结合从而提高对宫颈癌的诊断准确性的研究目前仍然较少。本研究探索了TVCDS 联合血清miRNA-18a、miRNA-92a 诊断宫颈癌的价值，发现其对宫颈癌具较高的诊断效能，可提高宫颈癌的早期诊断率，值得临床推广使用，为临床无创诊断宫颈癌提供了理论依据。

宫颈癌（CC）是严重危害女性健康的恶性肿瘤，在我国其发病率逐年上升［1-2］。人类乳头瘤病毒（HPV）检测是现在主要的CC 筛查方式［3］，但其特异度和阳性预测值较低［4-5］；脱落细胞学和病理学检查虽然特异度高，但对检查技术要求较高，无法重复检测。无创检查中，经阴道彩色多普勒超声（TVCDS）不仅可得到子宫肿瘤的位置和大小，还可以获取其供血状态［6］，但其诊断主要依赖专业经验，灵敏度和特异度均不高。血清学指标是诊断多种疾病简易有效的方式，但却没有特定的CC 血清学指标应用于临床中。既往研究显示，miRNA-18a 和miRNA-92a 在包括CC 在内的多种癌症患者的血清中水平升高［7-8］，但关于其是否可作为CC血清学检测指标的研究仍然较少。为此，本研究探索TVCDS 联合血清miRNA-18a、miRNA-92a 诊断CC 的价值，以期为临床无创诊断CC 提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2015 年3 月—2017 年7 月首都医科大学附属北京朝阳医院西区妇产科经术后病理诊断为CC 的患者122 例为CC 组；选取同期本院病理确诊为宫颈上皮内瘤变（CIN）的患者120 例为CIN 组（其中CIN 1～2 级54 例，CIN 3 级66 例）。CC 组 与CIN组纳入标准：（1）术后病理诊断明确；（2）术前行TVCDS 和血清miRNA-18a、miRNA-92a 检测，且临床资料完整者；（3）精神状态良好，生命体征平稳，能配合研究者。CC 组与CIN 组排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤、严重心脑血管疾病或肝肾功能不全者；（2）术后病理特征不典型者。选择同期本院确诊为子宫良性病变的患者120 例为正常组。正常组纳入标准：精神状态良好，生命体征平稳，能配合研究者。正常组排除标准：伴有明显的循环、呼吸和血液等系统疾病的患者。本研究经首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会同意，所有入选患者了解研究意义并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集 收集患者一般资料，包括年龄、BMI、高危型人类乳头瘤病毒（HR-HPV）感染情况、绝经情况、吸烟情况（每天吸烟1 支以上，连续或累计6 个月定义为吸烟）、其他性传播疾病情况。其中HR-HPV 感染情况检测方法如下：使用基因组DNA 提取试剂盒提取患者DNA，并置于-20 ℃冷藏；后取1～2 μl 样本，用PCR 试剂盒、PCR 扩增仪进行PCR 扩增；再用杂交试剂盒、医用核酸分子快速杂交仪检测是否有HR-HPV 感染。

1.2.2 TVCDS 检查 患者排空膀胱后取截石位，使用GE VolusonE8 彩色多普勒超声诊断仪进行检查，经阴道容积探头频率为5～9 MHz，涂少量耦合剂后套上两层隔离套，逐渐进入阴道、阴道穹窿部和宫颈处。探头分别做纵向、斜向、横向及多方位扫查。观察宫颈内、外口，宫颈管回声情况及宫颈是否整齐；再用彩色多普勒血流显像（CDFI）检测宫颈部位的血流分布情况，并记录血流阻力指数（RI）；最后仔细观察宫体、卵巢及宫旁各组织情况。所有研究对象由同一超声医师采用同一台超声仪完成检查。

1.2.3 血清采集及血清miRNA-18a、miRNA-92a 检测

采集空腹静脉血液标本5 ml，加入促凝管，4 ℃条件下4000 r/min 离心10 min（离心半径10 cm），再置于4 ℃条件下12000 r/min 离心15 min（离心半径10 cm），分离血清，分离好的血清暂时置于-80 ℃保存。取100～200 μl 血清，按照miRNeasy Mini Kit 试剂盒（德国QIAGEN 公司）说明书提取血清总RNA；按照All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit 试剂盒（美国GeneCopoeia 公司）说明书进行RNA 反转录，采用qPCR 法检测血清miRNA-18a、miRNA-92a，以U6 作为内参对照。

1.3 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行统计学处理。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验；CC影响因素分析采用多因素Logistic 回归分析；以术后病理诊断结果为金标准，绘制各指标诊断CC 的ROC 曲线，计算ROC 曲线下面积，通过约登指数确定诊断界值，并计算灵敏度、特异度。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较 3 组年龄、BMI、吸烟率、其他性传播疾病发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；3 组HR-HPV 感染发生率、绝经发生率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CIN 组、CC 组HR-HPV 感染发生率高于正常组，CC 组HR-HPV 感染发生率高于CIN组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CIN 组绝经发生率低于正常组、CC组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 TVCDS 检查结果 宫颈内、外口，宫颈管回声情况及宫颈是否整齐：CC 组和CIN 组均可见疑似癌变的宫颈异常表现，宫颈体积增大、轮廓改变，表面不光滑、连续中断，宫颈边缘不整，宫颈梭形结构破坏、肌层显示不清晰，内膜增厚。

宫颈部位的血流分布情况：CC 组CC 肿块内血管走行复杂错乱，彩色血流呈“火球”状或网状；CIN 组宫颈上皮内病变局部血流较丰富，可见数支棒状或条状血管；正常组宫颈内部没有或只有少许血流信号。

3 组血流RI 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；CIN 组、CC 组血流RI 均低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CC 组血流RI 低于CIN 组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

宫体、卵巢及宫旁各组织情况：3 组宫体、卵巢及宫旁各组织均为正常生理表现，通过子宫体矢状断面，可见宫体呈前位或后位，后位居多；内膜腔隙清晰可见，子宫内膜的回声与厚度均匀；肌层和浆膜层分别为中等和高强度回声。半冠状或半轴状平面，可见子宫内膜向输卵管口区延伸。宫体两侧可见子宫动脉，呈现形态各异的彩色血流。卵巢实质呈椭圆形低回声，排卵侧被膜下可见多个不均匀分布的小滤泡囊肿。偶见盆腔积液，盆腔积液较多时可见输卵管。

表13 组患者一般资料比较Table 1 Comparison of baseline data in 3 groups

2.33 组 血 清miRNA-18a、miRNA-92a 比 较 3 组血清miRNA-18a、miRNA-92a 比较，差异有统计学意 义（P＜0.05）；CIN 组、CC 组 血 清miRNA-18a、miRNA-92a 高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CC 组血清miRNA-18a、miRNA-92a 高于CIN 组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.4 CC 影响因素的多因素Logistic 回归分析 以患者是否患CC 为因变量（赋值：是=1，否=0），以年龄（赋值：实测值）、BMI（赋值：实测值）、HR-HPV 感染情况（赋值：有=1，无=0）、绝经情况（赋值：是=1，否=0）、吸烟情况（赋值：是=1，否=0）、其他性传播疾病情况（赋值：有=1，无=0）、血流RI（赋值：实测值）、血清miRNA-18a（赋值：实测值）、血清miRNA-92a（赋值：实测值）为自变量，进行多因素Logistic 回归分析，结果显示，年龄、HR-HPV 感染、绝经、血流RI、血清miRNA-18a、血清miRNA-92a 是CC 发生的影响因素（P＜0.05，见表4）。

2.5 血流RI、血清miRNA-18a、血清miRNA-92a、血流RI 联合血清miRNA-18a、血流RI 联合血清miRNA-92a 及 血 流RI 联 合 血 清miRNA-18a、miRNA-92a 诊 断CC 的 价 值 血 流RI 诊 断CC 的ROC 曲线下面积为0.844（P＜0.001），诊断界值为0.568，此时灵敏度为80.8%，特异度为68.0%；血清miRNA-18a 诊断CC 的ROC 曲线下面积为0.880（P=0.017），诊断界值为3.175，此时灵敏度为78.7%，特异度为83.7%；血清miRNA-92a 诊断CC的ROC 曲线下面积为0.763（P＜0.001），诊断界值为2.090，此时灵敏度为64.8%，特异度为81.8%；血 流RI 联 合 血 清miRNA-18a 诊 断CC 的ROC 曲线 下 面 积 为0.936（P＜0.001）， 灵 敏 度 为87.7%，特异度为85.8%；血流RI 联合血清miRNA-92a 诊断CC 的ROC 曲 线 下 面 积 为0.886（P＜0.001）， 灵敏度为82.8%，特异度为78.3%；血流RI 联合血清miRNA-18a、miRNA-92a 诊 断CC 的ROC 曲 线 下 面积为0.940（P＜0.001），灵敏度为94.3%，特异度为81.3%（见图1）。

表23 组血流RI 比较（±s）Table 2 Comparison of blood flow RI in 3 groups

表23 组血流RI 比较（±s）Table 2 Comparison of blood flow RI in 3 groups

注：RI=阻力指数；与正常组比较，aP＜0.05；与CIN 组比较，bP＜0.05

组别 例数 血流RI正常组 120 0.72±0.12 CIN 组 120 0.64±0.11a CC 组 122 0.51±0.12ab F 值 99.88 P 值 ＜0.001

表33 组血清miRNA-18a、miRNA-92a 比较（±s）Table 3 Comparison of serum miRNA-18a and miRNA-92a in 3 groups

表33 组血清miRNA-18a、miRNA-92a 比较（±s）Table 3 Comparison of serum miRNA-18a and miRNA-92a in 3 groups

注：与正常组比较，aP＜0.05；与CIN 组比较，bP＜0.05

组别 例数 血清miRNA-18a 血清miRNA-92a正常组 120 1.3±0.5 1.3±0.5 CIN 组 120 2.9±0.7a 1.9±0.5a CC 组 122 3.8±0.9ab 2.4±0.9ab F 值 372.39 83.36 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

图1 血流RI、血清miRNA-18a、血清miRNA-92a、血流RI 联合血清miRNA-18a、血流RI 联合血清miRNA-92a 及血流RI 联合血清miRNA-18a、miRNA-92a 诊断CC 的ROC 曲线Figure 1 ROC curve of blood flow RI，serum miRNA-18a，serum miRNA-92a，blood flow RI combined with serum miRNA-18a，blood flow RI combined with serum miRNA-92a，and blood flow RI combined with serum miRNA-18a and miRNA-92a in the diagnosis of cervical carcinoma

表4 CC 影响因素的多因素Logistic 回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of the influencing factors of cervical carcinoma

在我国，CC 是发病率和病死率仅次于乳腺癌的女性恶性肿瘤，其早期症状表现不典型，且目前的筛查诊断方式或在灵敏度或在特异度或在可操作性上存在缺陷，因此易错过最佳诊疗时机［9］。TVCDS 作为一种无创的影像学检查方法，不仅能直接显示宫颈、血管及管腔内血流状态，且能通过软件将结果量化，是一种便捷、有效的检查方式［10］。miRNAs 异常通过下调靶基因的表达，在肿瘤发生及生长中发挥重要作用［11］。miRNAs 在外周血中含量丰富且较稳定，是潜在的肿瘤血清学检测指标［12-13］。本研究探索TVCDS 联合血清miRNA-18a、miRNA-92a 诊断CC 的价值，以期为CC 提供高效、无创的筛查及诊断方式，为CC 的早期治疗提供理论基础。

本研究结果显示，CIN 组、CC 组HR-HPV 感染发生率高于正常组，CC 组HR-HPV 感染发生率高于CIN组，这与HR-HPV 感染是CC 和CIN 的高危因素相符［14］；CIN 组绝经发生率低于正常组、CC 组，提示CIN 患者在绝经后仍然有CC 发病高风险。3 组吸烟率、其他性传播疾病发生率无差异，与既往流行病学研究结果有出入［15］，这可能与本研究样本量有限有关，也可能是因为患者主观对相关因素有所隐瞒。

CC 肿瘤内的血流常表现为高速低阻的状态。本研究结果显示，CC 组CC 肿块内血管走行复杂，彩色血流呈“火球”状或网状；CIN 组宫颈上皮内病变局部血流较丰富，可见数支棒状或条状血管；正常组宫颈内部没有或只有少许血流信号；TVCDS 可以显示大部分肿瘤内有典型的血流信号，但需要有经验的超声科医生进行辨别，其诊断CC 的灵敏度和特异度受限。而血流动力学的数据变化可以更客观地对患者病情进行判断。CIN 组、CC 组血流RI 均低于正常组，CC 组血流RI 低于CIN 组，提示CC 肿瘤内有丰富的血供，而CIN 作为癌前病变，血管亦有异常生长。

临床研究表明，包括胃［16］、 结直肠［17］、肺［18］等在内的多种肿瘤发生发展或预后不良与血清miRNA-18a、miRNA-92a 相关［19］。本研究结果显示，CIN 组、CC 组血清miRNA-18a、miRNA-92a 高于正常组，CC 组血清miRNA-18a、miRNA-92a 高于CIN 组，与既往研究结果［20］一致；且miRNA-92a 具有促进血管增殖的作用，与TVCDS 检查结果中CC 肿瘤内丰富的血供结果相符。

多因素Logistic 回归分析结果显示，年龄、HR-HPV感 染、 绝 经、 血 流RI、 血 清miRNA-18a、 血 清miRNA-92a 是CC 发生的影响因素，提示上述因素可在一定程度上独立反映CC 的发病风险。对CC 发生的影响程度较大的有HR-HPV 感染、血清miRNA-18a、血流RI 和血清miRNA-92a，提示这4 个指标具有诊断CC 的潜力。然而根据临床经验，HR-HPV 感染诊断CC 特异度低，因此本研究深入探究了血流RI 和血清miRNA-18a、miRNA-92a 诊断CC 的价值。

本研究结果显示，血流RI、血清miRNA-18a、血清miRNA-92a、血流RI 联合血清miRNA-92a 诊断CC的ROC 曲线下面积均未达到0.900。而血流RI 联合血清miRNA-18a 诊断CC 的ROC 曲线下面积为0.936，灵敏度为87.7%，特异度为85.8%；血流RI 联合血清miRNA-18a、miRNA-92a 诊断CC 的ROC 曲线下面积为0.940，灵敏度为94.3%，特异度为81.3%；因此，血流RI 联合血清miRNA-18a、miRNA-92a 对CC 的诊断效能较好。

受样本量和工作条件的限制，本研究对HR-HBV感染与血清miRNA-18、miRNA-92a 的关系未进行深入研究。HR-HBV 感染作为CC 的高危发病因素，可能一定程度上影响血清学指标的变化。本研究仍有待多中心合作进行大范围的流行病学调查研究，同时与基础实验室合作，探究血清学指标变化的理论基础。

综上所述，CC 患者TVCDS 的血流RI 降低，血清miRNA-18a、miRNA-92a 升高；TVCDS 的血流RI 联合血清miRNA-18a、miRNA-92a 对CC 的诊断效能高于其单独诊断效能，且具有易操作的特点，可提高CC 的早期诊断率，值得临床推广使用。

作者贡献：孙明霞、蒋鹏程进行文章的构思与设计；孙明霞、于峰进行研究的实施与可行性分析；刘彩霞进行数据收集与整理、统计学处理、结果的分析与解释；孙明霞撰写论文，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理；范桂莲进行论文的修订；张辉进行英文的修订。

本文无利益冲突。