黄芪水煎剂对IR损伤大鼠肾小管细胞凋亡的影响及机制分析

周 刊，吕冬宁，陶志虎

（1.广西国际壮医医院，广西 南宁 530201；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530022）

肾小管坏死的主要原因是肾缺血再灌注损伤（ischemic reperfusion，IR），并由此导致临床急性肾损伤（AKI），在肾缺血再灌注损伤时肾小管上皮细胞凋亡过程的作用非常关键。细胞凋亡的影响因素非常多，其中Bcl-2家族基因是非常关键性的影响因素，能在很大程度调控肾IR损伤细胞凋亡。专家提出中药黄芪能够在一定程度上保护肾IR损伤，但其作用机制尚未明确［1-2］。本研究拟分析黄芪水煎剂（AE）对急性IR损伤大鼠肾小管细胞凋亡与Bcl-2、Bax表达的影响，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及用材 ①实验动物：从广西医科大学实验动物中心购进雄性健康SD大鼠［合格证号：SCXK（桂）2005-0001］30 只，体质量 200～220 g，大鼠喂养地点是广西中医药大学实验动物中心。②药物：黄芪生药水煎剂（浓度：0.2 g/ml）。③试剂：原位细胞凋亡（TUNEL）检测试剂盒（广西博士德生物工程有限公司）；DAB显色试剂盒及Trizol试剂（USA Invitrogen公司）；HRP标记的二抗、兔抗大鼠Bcl-2、兔抗β-actin、Bax单克隆抗体（USA Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组 30只大鼠按照随机数字表法分成假手术组、缺血再灌注损伤（IR）组和AE预处理组。

1.2.2 给药 在手术前3 d，AE预处理组给予黄芪水煎剂，经腹腔注射给药（0.2 g/ml/kg），每天1次，共3 d。假手术组与IR组经腹腔注射给予等量生理盐水。三组在最后一次给药（或生理盐水）后4 h予手术造模［3］。

1.2.3 造模与取材 三组选用麻醉注射剂为戊巴比妥钠（45 mg/kg），经腹腔注入，在腹正中部位制造创面，将双侧肾脏充分暴露，IR组、AE预处理组使用无损动脉夹将双侧肾动脉夹紧，维持45 min后松开无损伤动脉夹，恢复灌注状态，能够观察到肾脏颜色从暗红转至鲜红，提示灌注顺利，之后缝合切口［4］。假手术组只将双侧肾脏处于游离状态，并且进行1 h的暴露，再将腹腔切口缝合。三组手术结束6 h后进行第2次麻醉操作，将左肾摘除，予4%甲醛固定部分肾组织，固定维持1 d后用酒精按一定浓度梯度顺序脱水、石蜡包埋；另外剩余肾组织即时存储在液氮内，冻透之后存储条件为-80℃，以备RNA及蛋白质的提取检测［5］。

1.2.4 检测指标 ①肾组织caspase-3、caspase-8和caspase-9活性：采用荧光试剂盒检测。②肾小管上皮细胞凋亡指数：肾小管细胞凋亡率（%）为肾小管上皮凋亡阳性细胞数在肾小管总细胞数中的所占比例［6］。③肾组织Bax、Bcl-2表达：采用实时定量PCR法检测。

1.2.5 统计学方法 采用统计学软件SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料以“±s”表示，采用 t检验，以P＜0.05表示差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况比较 假手术组大鼠肾组织中极少见到凋亡细胞，细胞凋亡率为（2.91±0.41）%；IR 组肾小管上皮细胞凋亡率为（39.52±6.33）%，明显高于假手术组（P＜0.05），凋亡细胞主要集中在皮髓质交界和髓质；AE预处理组肾组织细胞凋亡率为（19.47±5.75）%，显著低于IR组（P＜0.05）。

2.2 三组大鼠肾组织Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和Fas表达情况比较 见表1、图1。

2.3 三组大鼠肾组织caspase-3、caspase-8和caspase-9表达情况比较 见表2、图2。

表1 三组大鼠肾组织Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和Fas表达值比较 （±s）

表1 三组大鼠肾组织Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和Fas表达值比较 （±s）

注：与假手术组相比，①P＜0.05；与 IR 组相比，②P＜0.05，下表同

组 别 n Bax（g/kg）Bcl-2（g/kg）Bax/Bcl-2 Fas（g/kg）假手术组 10 0.24±0.05 0.39±0.05 0.62±0.09 0.40±0.08 IR 组 10 0.71±0.29① 0.51±0.13① 1.35±0.19① 0.25±0.26①AE预处理组 10 0.51±0.14② 0.65±0.16② 0.81±0.15② 0.12±0.09②

图1 三组大鼠肾组织Bax、Bcl-2和Fas的表达情况

3 讨论

在手术过程中常常会出现肾IR损伤的症状，极有可能会诱发急性肾损伤（AKI），甚至会使得患者丧失肾功能，其中损伤最快的是肾小管上皮细胞，临床上相关研究提出肾IR损伤的关键性途径就是肾小管上皮细胞凋亡，所以，研究出抑制肾小管细胞凋亡的方法对AKI的预防来说具备临床价值［7-8］。AE可以凭借对IR大鼠Bax/Bcl-2基因表达的调节，对IR损伤大鼠肾小管细胞凋亡的整个过程形成制约作用，进而使得肾缺血再灌注损伤得到纠正。

表2 三组大鼠肾组织caspase-3、caspase-8和caspase-9 表达情况比较 （±s）

表2 三组大鼠肾组织caspase-3、caspase-8和caspase-9 表达情况比较 （±s）

组 别 n caspase-3（μM）caspase-8（μM）caspase-9（μM）假手术组 10 0.39±0.07 0.33±0.05 0.43±0.08 IR 组 10 0.77±0.14① 0.93±0.15① 0.90±0.13①AE 预处理组 10 0.59±0.08② 0.61±0.08② 0.63±0.11②

图2 三组大鼠肾组织caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白质表达情况

本研究数据显示肾缺血再灌注操作进行之后会显著增加肾小管细胞凋亡的总数，这与既往研究相符。细胞凋亡包括：线粒体途径，其中调控基因主要是抗凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax，两种基因实际比例会对细胞凋亡现象的形成产生较大影响［9］；死亡受体途径，死亡受体例如Fa-L和Fas结合之后，就会使得下游分子活化，进而启动细胞凋亡。上述两种方式都会使得Caspase活化，加速细胞凋亡。缺血性损伤之后细胞死亡的关键性模式就是凋亡，细胞凋亡的调控影响因素包括多种有关基因与对应的蛋白，基因主要包括抗凋亡基因与促凋亡基因［10］。近些年的报道中提出，Bcl-2与Bax是一种调控分子，严重影响肾缺血再灌注过程中细胞的存在状态，Bcl-2的影响程度最大，Bcl-2表达程度过高或Bcl-2/Bax比例提高都会使得Bax的表达受到制约，进而使得细胞凋亡过程被抑制，这种抑制的机理主要有以下几种可能：（1）对pr-ICE到ICE的转化过程形成制约，对促细胞凋亡基因信号的传达产生阻隔作用，或是使得相关基因失效［11］；（2）细胞器Ca2+内流出现变化，进而使得凋亡过程受到阻碍；（3）对氧自由基产生制约，体现为抗细胞凋亡效应；（4）和raf-1结合，促进细胞增殖，对凋亡产生抑制作用。增强Bax表达之后，线粒体通透性转换孔将处于开放状态，进而使得胞质内引入大量的细胞色素C，促进凋亡［12］。简而言之，Bax表达强化，会促进凋亡；Bcl-2表达强化，能制约凋亡，Bax/Bcl-2表达的平衡状态会在很大程度上影响细胞存在状态，其比值提高会促进凋亡，比值减小会抑制凋亡［13］。根据本研究结果得知，IR环节中细胞凋亡指数能够因为AE预处理的进行而减小，进而使得Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表达分别得到抑制、强化，Bax/Bcl-2比例也会因此减小，并且表现出显著的剂量依赖性，这就表明黄芪可以对凋亡相关基因进行调节，使得Bax/Bcl-2比例出现改变，并因此让比例趋近于1，对caspase3的表达产生抑制作用，进而避免出现肾小管细胞凋亡的现象，降低缺血性ARF的发生率［14］。

黄芪具有敛疮生肌、补气固表、排脓、利尿托毒的功效，常作为补益药运用于临床治疗中，适用于血虚、瘀、气虚等证候。肾缺血再灌注损伤表现为典型的气血虚弱、瘀血阻滞证候，运用黄芪有利于改善肾组织再灌注后损伤、降低钠排泄分数提高程度，对IR大鼠肾小管细胞凋亡产生显著抑制作用，其作用机理可能与其对Bcl-2、Bax表达的调节有较大关系［15］。同时，细胞凋亡的调节与其他复杂的机理也存在关系，黄芪水煎剂对肾小管细胞凋亡的制约效应和抗氧化效果的机理有待今后进一步研究，进而为临床运用黄芪进行缺血性AKI的防治提供可靠的实验依据。