八味龙钻颗粒的薄层鉴别研究

陆敏灵 ，覃洁萍 ，罗宇东 ，谭红声 ，梁梓敏 ，郭海娇

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 530023）

八味龙钻颗粒是由飞龙掌血、两面针、大钻、青风藤、五指毛桃及九龙藤等八味药材按照壮医药理论合理配伍制成的颗粒剂，经长期临床应用，该制剂对于风湿性免疫系统疾病有较好的疗效。处方中九龙藤、大钻（又名大血藤）［1］常用于治疗风湿性免疫系统疾病，九龙藤中的黄酮类成分显示较强的镇痛抗炎活性；飞龙掌血在民间多用于治疗风湿性关节炎［2］；青风藤中青藤碱具有抗炎［3］、抗风湿［4］、免疫抑制［5-6］等药理作用；两面针具有消肿止痛作用［7-8］；五指毛桃可以健脾益气，化湿舒筋［9］。以上各药材及成分均为该制剂的主要功效成分。为了更好地保证该制剂的质量和疗效，本文对该制剂中的君药飞龙掌血、大血藤和臣药两面针、青风藤、五指毛桃及九龙藤建立起薄层色谱鉴别方法，为其质量标准的制定提供实验基础和依据。

1 实验材料

1.1 仪器 KQ5200超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HWS-26电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；SQP十万分之一电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；ZF-7紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；双槽展开缸。

1.2 试药 甲醇、乙酸乙酯、甲酸、二甲苯、三氯甲烷、异丙醇、乙醚、乙醇、正己烷、乙酸、氨水均为分析纯；硅胶G（青岛海洋化工有限公司，薄层层析用）；显色剂：磷钼酸、碘化铋钾、硫酸乙醇。6批八味龙钻颗粒（批号 ：20170101、20170502、20170503、20170701、20170702、20170703）均由广西中医药大学制药厂提供；实验所有原药材八角枫、大钻、飞龙掌血、鸡血藤、两面针、九龙藤、五指毛桃、青风藤均购自广西玉林市祥生中药饮片有限责任公司，并经广西中医药大学制药厂质量保证部李娜主管药师鉴定；白屈菜红碱对照品（批号：111718—201402）购自中国食品药品检定研究院）。

2 方法与结果

2.1 飞龙掌血的薄层鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备 称取八味龙钻颗粒约2 g，加乙醇40 ml，超声处理60 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 ml溶解，作为供试品溶液。

2.1.2 飞龙掌血药材溶液制备 取飞龙掌血粉末适量，与供试品溶液同法制备，作为飞龙掌血药材溶液。

2.1.3 对照品溶液制备 取白屈菜红碱对照品适量，用甲醇溶解。

2.1.4 阴性对照液制备 按处方工艺制备缺飞龙掌血和两面针的阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照液。

2.1.5 鉴别结果 照薄层色谱法（中国药典2015年一部附录ⅥB）［10］试验，吸取阴性对照液 1.5 μl、供试品溶液 1 μl、飞龙掌血药材溶液 0.2 μl、白屈菜红碱对照品溶液0.2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（30∶1∶0.1）为展开剂，室内条件：T=30℃，RH=72%，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。在供试品色谱中，在与飞龙掌血药材色谱主斑点相应的位置上，显相同颜色的橙色荧光斑点，在与白屈菜红碱对照品色谱相应的位置上，显相同的橙色荧光斑点，阴性对照未见干扰。见图1。

图1 飞龙掌血的薄层鉴别图

2.2 两面针薄层鉴别

2.2.1 供试品溶液的制备 取八味龙钻颗粒约2 g，加乙醇40 ml，超声处理60 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣用乙醇1 ml溶解，作为供试品溶液。

2.2.2 两面针药材溶液的制备 取两面针粉末适量，与供试品溶液同法制备，作为两面针药材溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备 取白屈菜红碱对照品适量，用甲醇溶解。

2.2.4 阴性对照液的制备 按处方工艺制备缺飞龙掌血和两面针的阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照液。

2.2.5 鉴别结果 照薄层色谱法［10］试验，吸取供试品溶液 1 μl、两面针药材溶液 0.2 μl、白屈菜红碱对照品溶液 0.5 μl、阴性对照液 1.5 μl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（20∶5∶3∶1∶0.1）为展开剂，室内条件：T=30 ℃，RH=72%，预饱和10 min，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。在供试品色谱中，在与两面针药材色谱和白屈菜红碱对照品色谱相应的位置上，显相同的橙色荧光斑点，阴性对照未见干扰。见图2。

图2 两面针的薄层鉴别图

2.3 大钻薄层鉴别

2.3.1 供试品溶液的制备 称取八味龙钻颗粒约2 g，加甲醇50 ml，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加适量2%氢氧化钠溶解，用稀盐酸调节滤液pH值至2，用乙醚振摇萃取3次，每次10 ml，过滤，合并乙醚液，滤液蒸干，用2 ml甲醇溶解，作为供试品溶液。

2.3.2 大钻药材溶液的制备 取大钻粉末适量，与供试品溶液同法制备，作为大钻药材溶液。

2.3.3 阴性对照液的制备 按处方工艺制备缺鸡血藤、九龙藤及大钻的阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照液。

2.3.4 鉴别结果 按照薄层色谱法［10］试验，精密吸取供试品溶液6μl、大钻药材溶液2μl、阴性对照液1.5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶1∶0.1）为展开剂，室内条件：T=30 ℃，RH=72%，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。在供试品色谱中，在与大钻药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照未见干扰。见图3。

图3 大钻的薄层鉴别图

2.4 青风藤薄层鉴别

2.4.1 供试品溶液的制备 称取八味龙钻颗粒2 g，加无水乙醇60 ml（分2次），超声处理2次，每次30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇萃取2次，每次20 ml，正丁醇液再用水洗2次，每次20ml，合并水液，滤液蒸干，残渣用无水乙醇2 ml溶解，作为供试品溶液。

2.4.2 青风藤药材溶液的制备 取青风藤粉末适量，与供试品溶液同法制备，作为青风藤药材溶液。

2.4.3 青藤碱对照品溶液的制备 取青藤碱适量，用甲醇溶解。

2.4.4 阴性对照液的制备 按处方工艺制备缺青风藤的阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照液。

2.4.5 鉴别结果 按照薄层色谱法［10］，吸取供试品溶液 6 μl、青风藤药材溶液 2 μl、青藤碱对照品溶液 2 μl、阴性对照液3 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）10 ℃以下放置的上层溶液为展开剂，室内条件：T=30℃，RH=72%，置浓氨试液预饱和20 min的展开缸内展开，取出，晾干，依次喷以改良碘化铋钾试液。在供试品色谱中，在与青风藤药材及青藤碱对照品色谱相应的位置上，显相同橙红色的斑点，阴性对照未见干扰。见图4。

图4 青风藤的薄层鉴别图

2.5 五指毛桃薄层鉴别

2.5.1 供试品溶液的制备 称取八味龙钻颗粒2 g，加无水乙醇40 ml，超声处理60 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 ml溶解，作为供试品溶液。

2.5.2 五指毛桃药材溶液的制备 取药材2.5 g，加乙酸乙酯25 ml，超声处理25 min，放冷，滤过，滤液蒸干，用乙酸乙酯2 ml溶解，作为五指毛桃药材溶液。

2.5.3 补骨脂素对照品溶液的制备 取补骨脂素适量，用甲醇溶解。

2.5.4 阴性对照液的制备 按处方工艺制备缺五指毛桃的阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制备，作为阴性对照液。

2.5.5 鉴别结果 按照薄层色谱法［10］试验，吸取供试品溶液 6 μl、五指毛桃药材溶液 2 μl、补骨脂素对照品溶液 1 μl、阴性对照液 1 μl，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（8∶2）为展开剂，室内条件：T=30℃，RH=72%，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。在供试品色谱中，在与五指毛桃药材色谱和补骨脂素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的蓝色荧光斑点，阴性对照未见干扰。见图5。

图5 五指毛桃的薄层鉴别图

2.6 九龙藤薄层鉴别

2.6.1 供试品溶液的制备 称取八味龙钻颗粒1.0 g，加三氯甲烷-甲醇（8∶2）10 ml，振荡 20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。

2.6.2 九龙藤药材溶液的制备 取药材1 g，加三氯甲烷-甲醇（8∶2）10 ml，振荡 20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为九龙藤药材溶液。

2.6.3 阴性对照液的制备 按处方工艺制备缺九龙藤、鸡血藤和大钻的阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制备，作为阴性对照液。

2.6.4 鉴别结果 按照薄层色谱法［10］试验，吸取供试品溶液 6 μl、九龙藤药材溶液 0.5 μl、阴性对照液 1 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60°～90°）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶4∶1.5∶0.75）为展开剂，室内条件：T=30℃，RH=72%，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。在供试品色谱中，在与九龙藤药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照未见干扰。见图6。

图6 九龙藤的薄层鉴别图

3 讨 论

3.1 对照品的选择 飞龙掌血与两面针药材的主要活性成分为白屈菜红碱和氯化两面针碱，故在这两个药材TLC鉴别条件摸索时，曾尝试使用白屈菜红碱和氯化两面针碱共同作为参照物进行颗粒与药材的鉴别，但由于该制剂颗粒中氯化两面针碱含量不稳定，多个批次样品氯化两面针碱的斑点无法清晰的展现，故确定在该制剂的飞龙掌血与两面针TLC鉴别中仅采用白屈菜红碱作为对照指标性成分。青藤碱为青风藤指标性成分，补骨脂素为五指毛桃指标性成分，故分别作为这两个药材鉴别的对照指标性成分。大钻、九龙藤药材由于在颗粒中共有成分较多，没找到合适的对照指标成分，故本实验仅使用对照药材进行鉴别，没有选择单一成分对照品作为鉴别指标。

3.2 温湿度的考察 在考察实验条件时，分别对飞龙掌血、两面针、大钻、青风藤、五指毛桃及九龙藤各药材的TLC展开温湿度进行了考察。分别考察了温度4～10℃、30℃及相对湿度32%、72%的影响，结果显示温度对六味药材的分离效果均无显著影响，但在相对湿度32%下对飞龙掌血影响较大，对其它药材均无影响。

3.3 展开剂的考察 飞龙掌血考察了三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（30∶1∶0.1）、三氯甲烷-甲醇（25∶1）和三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（30∶3∶0.2）这三个展开系统，分离效果均较好，经过比较之后选择三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（30∶1∶0.1）为飞龙掌血的展开剂。两面针考察了二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液 （20∶5∶3∶1∶0.1）、环己烷-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（20∶5∶3∶1∶0.1） 和环己烷-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（15∶10∶3∶1∶0.1），三种展开系统分离效果均较好，但二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（20∶5∶3∶1∶0.1）展开系统有适宜的比移值，因此选用其为两面针的展开剂。大钻考察了乙酸乙酯-丙酮-甲酸（16∶5∶0.1）、三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶5∶0.1）和三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶1∶0.1）这三种展开系统，都可以将有效成分分离，但三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶1∶0.1）分离的斑点较明显，比移值较好，所以选用其为大钻的展开剂。青风藤按照薄层色谱法（中国药典2015年版一部附录VIB）试验中展开系统甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1），由于甲苯毒性较大，用极性相近的有机溶剂二甲苯替换，如氯仿、二氯甲烷、二甲苯等，但氯仿及二氯甲烷与其他展开剂分层不明显，二甲苯的展开系统分离效果较好，能明显将成分分离出来，选择考察了二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）、氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）和二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶4∶2∶1）展开系统，均能分离，但二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）不会形成二次展开，所以选择其作为青风藤展开系统。五指毛桃选择正己烷-乙酸乙酯（8∶2）、环己烷-氯仿（8∶2）、甲苯-乙酸乙酯（7∶3）、正己烷-乙酸乙酯（10∶2）及正己烷-乙酸乙酯（10∶5）五种展开系统考察，正己烷-乙酸乙酯（8∶2）能充分将成分分离，故选择其为五指毛桃的展开系统。九龙藤考察石油醚（60°～90°）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶4∶1.5∶0.75）、石油醚（60 °～90 °）-环己烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶4∶1.5∶0.75）和石油醚（60 °～90 °）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶2∶1.5∶0.75）三种展开系统，比较了这三种展开系统，石油醚（60°～90°）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶4∶1.5∶0.75）这个系统可以将有效成分分离，确定其为九龙藤的展开系统。为了增加本实验数据的可信度，避免误差，本实验选择了6个批次的八味龙钻颗粒作为供试品。

八味龙钻颗粒作为复方中药制剂，原质量标准单单只对某一类化学物质进行理化鉴别，专属性不强，为了更加准确地控制其质量标准，本实验在原质量标准基础上增加了对制剂中飞龙掌血、两面针、大钻、青风藤、五指毛桃及九龙藤六味药材的鉴别，实验结果显示本文建立的方法专属性强，稳定性及重现性好。本研究为八味龙钻颗粒的质量标准提供了实验基础和方法依据。本文建立八味龙钻颗粒的薄层鉴别法（TLC法），在主要成分的鉴别中，6批八味龙钻颗粒溶液的特征斑点与六味药材以及对照品的特征斑点颜色一致、大小相同且斑点清晰。薄层色谱专属性强，分离效果好，操作简便，重现性好，结果可靠，能较好地控制八味龙钻颗粒的质量。