活血胶囊激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路对血管内皮细胞发挥抗氧化损伤作用*

赵 静，袁瑞华，王海芳，邓国荣，张琳萍，曹情雯，霍雪萍，赵向绒，刘勤社△

（1.陕西中医药大学中西医结合心血管病专业，陕西省中西医结合心血管病防治重点实验室，陕西 西安 712046；2.陕西中医药大学第二附属医院心内科，陕西 西安 712000；3.西安交通大学医学部中西医结合心血管专业，陕西 西安 710061；4.陕西省中医医院医疗管理处，陕西 西安 710003；5.陕西省人民医院中心实验室，陕西 西安 710068）

血管内皮层不仅是血液和组织的屏障，还能够合成多种血管活性物质，从而调节血管张力和血管通透性。血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）在创伤修复、血管生成、止血等一系列生理和病理过程中发挥着重要作用。VEC损伤是多种疾病发生、发展的基础，保持VEC结构和功能的完整性对于维持心血管系统稳态调节极为重要。VEC损伤和功能失常与多种心血管疾病（如冠心病、高血压、糖尿病等）均有密切的关系。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是老年性慢性心血管疾病的共同病理基础，而引起AS的主要原因之一是VEC氧化损伤。从整体、细胞、分子水平研究对VEC具有抗氧化损伤作用的药物对于心血管疾病的防治研究具有重要意义[1]。

活血胶囊（以下简称HXJN）由黄芪、红花、赤芍、川芎、桃仁、牛膝、当归、生地、枳壳、桔梗、酸枣仁、甘草12味中药组成，具有补气养血、活血化瘀、理气安神等功效，临床用于治疗冠心病气虚血瘀证具有良好疗效，但其药理学作用机理和分子机制尚未完全阐明。既往动物实验表明，HXJN可缩小动脉粥样硬化斑块面积，减少斑块内巨噬细胞浸润，降低斑块内炎性因子表达，具有抗炎和增强斑块稳定性的作用[2-3]。笔者前期对于黄芪、红花和赤芍等药材中主要活性成分的药理学研究显示，黄芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）[4]、黄芪皂苷 III[5]、羟基红花黄色素 A（hydroxy-Safflower Yellow A，HSYA）[6]和芍药苷（ paeoniflorin，PF）[7]等活性单体成分可抑制血管内皮细胞的炎性反应，同时还具有不同程度的抗氧化作用[8-10]。然而单个药物成分的研究既不能如实反映复方中的活性成分含量与比例关系，也难以体现不同成分的综合作用，不能够全面阐释复方的药理学作用和作用机制。因此，本研究通过制备HXJN含药血清和提取物水溶液，离体培养小鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，bEND.3），采用 H2O2诱导细胞氧化损伤模型，研究HXJN的抗氧化损伤作用及其相关分子机制，为其药理学作用提供直接的实验室证据。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠bEND.3细胞购自上海拜力生物技术公司。RPMI-1640细胞培养基和胎牛血清购自Clontech公司。PI3K抑制剂LY294002、Akt抑制剂perifosine、Nrf2抑制剂 ML385，以及WST-1细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒、细胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒均购自碧云天生物技术公司。RNA提取试剂盒、反转录及qRT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。抗β-actin抗体、抗ph-Akt/Akt一抗和抗ph-Nrf2/Nrf2一抗购自美国Cell signaling公司，抗HO-1一抗购自美国Abcam公司。所用二抗购自北京康为世纪生物科技公司。主要仪器有CO2细胞培养箱（美国Napco公司），倒置光学显微镜（日本Olympus公司），台式冷冻离心机Allegra 64R（德国Beckman公司），Model 680型酶标仪（美国Bio-Rad公司），Eco Real-Time PCR扩增仪（美国Illumina公司）和化学发光仪（美国Alpha Innotech公司）。

1.2 方法

1.2.1 含药血清制备 健康雄性SD大鼠，体质量200～220 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（陕）2012-003。按照人用剂量换算大鼠给药剂量，将HXJN（西安大唐制药集团有限公司生产，批号：B20020336）配制成 0.09 g/mL生理盐水溶液，每只大鼠每次灌胃2 mL，对照组灌服等量生理盐水，1日2次，连续5 d，末次给药前禁食12 h，给药后1 h麻醉动物后经腹主动脉取血，离心分离血清，56℃灭活30 min，过滤除菌，分装，-80℃保存备用。

1.2.2 HXJN提取物溶液制备 将3粒活血胶囊（0.9 g）溶于6 mL无血清RPMI-1640细胞培养基，充分溶解，3 000 rmp离心5 min，过滤除菌，分装，-80℃保存备用。

1.2.3 细胞培养 在 37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，bEND.3细胞贴壁生长于含有10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液中，0.025%胰酶消化传代。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.4 细胞活力检测 将细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，加入200 μL完全培养液培养，每组设5个复孔。次晨换为100 μL含不同浓度含药血清或HXJN提取物的新鲜培养液处理。24 h后每孔加入10 μL WST-1溶液，在细胞培养箱内继续孵育1~1.5 h，充分混匀，450 nm处测定吸光度。采用公式“细胞活力值（实验组）=[OD（实验组）/OD（对照组）]×100%”计算各组细胞活力值。

1.2.5 实时定量 RT-PCR检测HO-1基因表达bEND.3细胞在6孔培养板中生长至90%铺满，以高浓度（750 μg/mL）HXJN 提取物处理细胞 4、8、16 h，利用TRIzol试剂裂解细胞收集裂解液，提取总RNA。按照反转录试剂盒说明书以1 μg总RNA为模板反转录出cDNA链。按照试剂盒说明书以cDNA为模板进行PCR反应。引物：β-actin：正向引物 5′-TAGGCGGACTGTTACTGAGC-3';反向引物 TGCTCCAACCAACTGCTGTC；HO-1：正向引物 5′-GCTCACGGTCTCCAGTC-GCC-3′；5′-GGCGACTGGAGACCGTGAGC-3′。反应条件：95 ℃变性 1 min，58 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，设35个循环。以β-actin作为内参基因，计算同一样本中目的基因的含量比值，评价目的基因表达水平。

1.2.6 Western Blot检测目标蛋白表达 生长于6孔细胞培养板中的细胞经过适当药物处理后，每孔加入100 μL 2×SDS样品缓冲液，直接收集细胞裂解物；或采用试剂盒分离胞浆蛋白和核蛋白。采用氨基黑法进行蛋白定量。95℃变性10 min后按照目标蛋白分子量进行SDS-PAGE电泳分离蛋白（蛋白上样量为20~30 μg），转硝酸纤维素膜，用50 g/L脱脂牛奶室温封闭60 min，一抗（1∶500）4℃孵育过夜，二抗（1∶1 000）室温孵育 1 h，TBST 洗膜，ECL 法发光，在化学发光影像分析系统检测抗体信号，利用Image J软件进行灰度分析，以β-actin作为内参计算蛋白相对表达水平的变化。蛋白表达检测实验进行至少3次，给出具有代表性的结果图。

1.2.7 统计学处理 应用SPSS 14.0软件进行统计分析，结果采用均数±标准差（±s）表示。首先用方差分析检验各组是否有显著差异，存在显著差异时采用学生t检验分析均数间是否有显著性差异。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HXJN含药血清对细胞活力和H2O2诱导细胞损伤的影响 首先检测不同浓度HXJN含药血清处理24 h对bEND.3细胞活力的影响。结果如图1A显示，2.5%、5%和10%浓度含药血清对细胞活力无显著影响，但在20%浓度时可引起细胞活力显著降低（P<0.01），因此后续实验选用最高10%浓度进行研究。图 1B显示，H2O2作用 3 h可呈浓度依赖性诱导细胞活力降低，表明发生氧化损伤，显微镜下观察在100 μM以上剂量组可见细胞出现明显的变圆、皱缩、破裂及脱落现象。10%含药血清预处理24 h可显著减轻 H2O2对细胞活力的影响（P<0.01），但不能恢复到对照组水平。

2.2 HXJN提取物对H2O2诱导细胞氧化应激损伤的保护作用 检测HXJN提取物处理24 h对 bEND.3细胞活力的影响，结果如图 2A所示，HXJN在150、300和 750 μg/mL浓度均可引起细胞活力升高（P<0.01）。图 2B 显示，200 μM H2O2作用 3 h 可使细胞活力明显减低，约为对照组的 40% （P<0.01），表明发生氧化损伤。采用750 μg/mL HXJN提取物预处理 24 h可显著减轻 H2O2对细胞活力的影响（P<0.01）。300 μM H2O2可使细胞活力减低至约为对照组的 20%（P<0.01），此时HXJN不能减轻 H2O2的损伤作用。

图1 HXJN含药血清对bEND.3细胞活力的影响

图2 HXJN提取物对bEND.3细胞活力的影响

2.3 HXJN诱导细胞中HO-1 mRNA和蛋白表达水平上调 血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是一种广泛存在于各种细胞中的具有抗氧化、抗凋亡、抗炎症等保护作用的重要分子，对于维持细胞氧化还原稳态具有重要意义。图 3A显示，750 μg/mL HXJN提取物作用4、8、16 h均可检测到细胞中HO-1 mRNA表达水平显著上调（P<0.01）。图 3B显示，HXJN提取物作用4、6和8 h可显著上调 HO-1蛋白的表达（P<0.01），提示其可能与HXJN对细胞的抗氧化损伤作用有关。

图3 HXJN提取物诱导bEND.3细胞中HO-1的表达

2.4 PI3K/Akt信号通路参与HXJN对 HO-1表达的调控 图4A显示，正常血清和含药血清均可上调ph-Akt蛋白的表达水平，提示Akt被激活。由于血清对Akt蛋白磷酸化具有激活作用，为了去除血清对实验结果的影响，我们采用HXJN提取物在无血清条件下进一步研究HXJN对Akt磷酸化的影响。结果如图4B显示，750 μg/mL HXJN作用于细胞在15 min和30 min时即可检测到ph-Akt蛋白水平显著升高。同时，如图 4C显示，与 HXJN组相比，应用PI3K抑制剂 LY294002（LY，20 μM）和 Akt抑制剂 perifosine（10 μM）预处理可显著抑制HXJN对HO-1蛋白表达的上调作用（P<0.01），表明PI3K/Akt信号通路参与HXJN对HO-1表达的调控。

图4 PI3K/Akt信号通路参与HXJN对HO-1表达的调控

图5 PI3K/Akt/Nrf2信号通路参与HXJN对HO-1表达的调控

2.5 PI3K/Akt/Nrf2信号通路参与介导HXJN对HO-1表达的调控作用 图 5A显示，HXJN提取物作用于细胞后在5 min和15 min即时可检测到转录因子 Nrf2（NF-E2-related factor 2）发生磷酸化，随后30 min时ph-Nrf2水平基本恢复正常。HXJN作用60 min时可检测到细胞核中 Nrf2蛋白水平升高，表明其发生了核转位，提示转录活性增强。应用PI3K抑制剂 LY294002（LY，50 μM）预处理细胞可抑制HXJN对Nrf2核转位的诱导作用。图5B显示，HXJN可诱导HO-1 mRNA表达上调，而应用Nrf2抑制剂ML385（10 μM）可显著抑制 HXJN的诱导作用（P<0.01）。图5C显示，HXJN可显著促进HO-1蛋白表达（P<0.01），而应用ML385可显著阻断HXJN对HO-1蛋白表达的促进作用（P<0.01），提示 HXJN可通过转录因子Nrf2介导HO-1的表达，而PI3K/Akt/信号调控Nrf2磷酸化和核转位增强其转录活性。

3 讨论

活血胶囊（HXJN）具有补气养血、活血化瘀、理气安神的功效，近年来临床常用于气虚血瘀型心血管病的辅助治疗。动物实验已证明，HXJN对动物AS模型具有抗炎和增强斑块稳定性的作用，但其药理学作用和分子机制都尚未完全阐明。尽管以往对黄芪、红花、赤芍等药材中主要活性成分的药理学研究显示，许多活性单体成分都具有不同程度的抗氧化作用，本研究则通过制备HXJN含药血清和提取物溶液，直接研究其对H2O2诱导bEND.3细胞氧化损伤模型的保护作用，并对其机制进行研究。

本研究结果显示，HXJN含药血清和提取物均对H2O2诱导的细胞氧化损伤具有抑制作用。进一步研究显示，HXJN可诱导 bEND.3细胞中重要的抗氧化酶HO-1基因和蛋白表达升高，可能是其发挥抗氧化作用的基础。HO-1是体内最广泛存在的一种重要的抗氧化防御酶，主要催化血红素分解代谢成亚铁、一氧化碳和胆绿素，近年来其功能及调控备受关注，已成为药物开发的重要靶点[11]。研究表明HO-1不仅在维持细胞内氧化还原的平衡中起着重要的作用，同时还具有抗炎和抗凋亡[12]作用，并在肿瘤预防中发挥重要作用[13]。不过，HO-1的过度表达则可能促进肿瘤的发生发展[14]。正常情况下HO-1在大多数组织内呈低水平表达，可为多种伤害性刺激包括缺氧、细胞因子、H2O2、脂质、NO等诱导表达升高，许多药物可通过诱导HO-1表达而发挥保护作用。HO-1的重要作用之一是参与血管保护。HO-1的表达升高可以对诸如AS和心肌缺血-再灌注损伤等心血管疾病起防御保护作用[15-16]。因此，本研究为HXJN通过抗氧化作用而发挥心血管系统保护作用提供了依据。

研究显示在HO-1启动子序列中存在类似抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）的结合位点，因此其表达受转录因子Nrf2调控。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子，通过诱导调控一系列抗氧化蛋白的组成型和诱导型表达，减轻ROS和亲电体引起的细胞损伤，发挥保护作用。Nrf2蛋白在机体的多种组织（如肝、肾、脾、心等）的细胞内广泛表达，提示这些器官的慢性疾病发病机制可能与Nrf2活性缺乏有关[17]。正常生理状态下，Nrf2与其抑制蛋白 Keap-1（Kelch-like ECH-associated protein-1）相结合存在于细胞质中，并通过Keap1-Cul3-Rbx依赖的泛素化过程保持平衡而处于非活性状态。在氧化应激或药物诱导条件下，Nrf2和/或Keap-1发生磷酸化，Nrf2与Keap-1解离并转位进入细胞核，在细胞核内积聚并进一步识别、结合抗氧化反应元件ARE，从而启动受Nrf2调控的抗氧化酶基因转录表达[18]。本研究结果可见，应用Nrf2抑制剂可抑制HXJN对HO-1表达的上调，提示Nrf2参与介导HXJN对HO-1表达的调控。Nrf2/HO-1是保护心血管系统对抗氧化损伤的重要途径[19-20]。我们的研究结果显示，HXJN可诱导Nrf2磷酸化，亦可促进其向细胞核内转位，应用Nrf2抑制剂可抑制HO-1的表达，提示HXJN可通过调控Nrf2转录活性而诱导HO-1表达，因此这可以部分解释HXJN对心血管疾病的治疗作用。值得注意的是，研究显示Nrf2可激活人类基因组中500多种基因的转录，这些基因大多数具有细胞保护功能。基于以往对疾病动物模型研究，提高Nrf2活性对于许多其他疾病（神经退行性病变、慢性肾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病等）具有改善作用[21]，这提示HXJN可能对其他老年性慢性疾病也具有改善作用。

本研究对HXJN激活Nrf2的机制进行进一步研究的结果表明，HXJN可通过诱导Akt磷酸化使之激活。应用PI3K/Akt信号通路抑制剂可抑制HXJN引起的Nrf2核转位的水平，并且抑制HXJN引起的HO-1表达上调，表明PI3K/Akt信号通路参与了HXJN对Nrf2转录活性的调控。但目前的结果尚不能完全排除其它信号途径如ERK1/2或p38等的作用。

综上所述，HXJN可激活 bEND.3中 PI3K/Akt/Nrf2信号通路，从而激活下游分子 HO-1的表达，发挥抗氧化作用，抑制内皮功能失调和动脉粥样硬化进程。除抗氧化作用之外，PI3K/Akt/Nrf2信号通路及HO-1蛋白还与抗炎作用、抗细胞衰老作用密切相关，同时也是细胞自噬的重要信号途径。尽管多种药物单体成分对PI3K/Akt/Nrf2信号通路的激活作用已有报告，但采用复方直接研究，活性成分组成与比例更能够反应其整体作用，为HXJN对AS和冠心病发挥预防和治疗作用提供了细胞水平的直接证据。