基于网络药理学的六味地黄丸治疗冠心病的分子机制研究*

杨志华，刘 琰，闫海峰，姬艳苏，王淑萍△

(1.天津中医药大学，天津 301617；2.武警特色医学中心，天津 300162)

冠心病是我国最常见的心血管疾病之一，归属中医学“胸痹”“真心痛”的范畴，临床多以胸背痛、胸中窒闷、心悸、气短为主要表现。流行病学调查显示，我国冠心病人数高达1 100万，且死亡率呈上升趋势[1]。本病的发生多与外感寒邪、饮食不节、情志失调、劳倦内伤、年老体虚等因素有关[2]，好发于40岁以上的中老年人[3]，《素问·阴阳应象大论》中记载：“年四十，而阴气自半也，起居衰矣。”人至中年，肾气自半、精血渐衰、肾阴亏虚，不能濡养五脏之阴，心脉失于濡养而发为胸痹，肾阴虚是冠心病发生发展的重要病理基础[4]。

六味地黄丸原名“地黄丸”，被誉为“补阴方药之祖”，首载于宋·钱乙《小儿药证直决》，系钱乙从《金匮要略》的肾气丸中减去桂枝、附子而成，由熟地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、泽泻、茯苓6味药物组成，具有填精滋阴补肾之功效，主治肾阴不足证[5]。有医家从肾论治冠心病，运用六味地黄丸加减治疗冠心病取得很好的临床疗效[6-9]。由于中药及其复方具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，这种复杂性使其作用机制不明确。网络药理学是指将药物作用网络与生物网络整合在一起，分析药物在此网络中与特定节点或模块的相互作用关系，从而理解药物和机体相互作用的科学[10]，从整体观角度认识药物与疾病间的相互作用[11]。本文通过运用网络药理学探讨六味地黄丸治疗冠心病的药物成分及可能的分子作用途径，通过建立“药物成分-靶点-通路”之间的关系，分析该方治疗冠心病的作用机制，以期为冠心病相关的基础实验研究及六味地黄丸的临床合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 六味地黄丸活性成分的筛选 运用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）筛选六味地黄丸全方中熟地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮的所有化学成分，建立六味地黄丸全方中药化学成分数据库。药物在人体内要经过吸收、分布、代谢和排泄（ADME）过程才能到达靶器官发挥其治疗作用，基于口服生物利用度（oralbioavailability，OB）、类药性（Drug-likeness，DL）是筛选药物的关键参数，以ADME参数中的OB≥30%、类药性DL≥0.18[13-14]为限制条件进行初步筛选，汇总结果、去除重复、删除没有相关信息的化学成分，即为六味地黄丸治疗冠心病相关的生物活性成分。

1.2 六味地黄丸活性成分的潜在靶蛋白的收集及网络构建 根据已筛选的六味地黄丸全方中药活性成分，通过TCMSP平台检索与候选化合物相关的潜在靶点，并通过 Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org/）将预测出的靶点蛋白名转换为基因名。将筛选的潜在靶点导入Cytoscape3.2.1软件，构建6味中药及其化学成分、潜在靶点的网络可视化图。

1.3 冠心病相关靶点的筛选 利用TTD、Drugbank、DisGeNET数据库进行检索，数据库以“coronary heart disease”为检索词，收集与冠心病相关的靶点，并删除假阳性和重复基因，最终确定冠心病相关靶基因。

1.4 构建六味地黄丸治疗冠心病的相关网络图 采用Cytoscape3.2.1软件构建六味地黄丸治疗冠心病的相关网络图。将筛选的六味地黄丸的活性成分及其靶点导入Cytoscape 3.2.1软件，构建“中药-化合物-靶点”网络。为明确六味地黄丸潜在靶点与冠心病相关靶点之间的相互作用，将药物靶点与疾病靶点取交集，筛选出六味地黄丸与冠心病的共同靶点，通过Cytoscape3.2.1建立冠心病相关性的“化合物-靶点-冠心病”网络。其中的节点（node）代表化合物、靶蛋白或疾病，边（edge）代表这些节点之间的互作关系，即某个成分与靶点或靶点与疾病之间的联系。

1.5 蛋白-蛋白相互作用网络构建 将筛选到“疾病-药物成分”共同靶点导入String数据库（https：//string-db.org/），构建蛋白-蛋白相互作用网络，将物种设置为“Homo sapiens”，为确保数据的可靠性，蛋白最低相互作用阈值设为“highest confidence”（＞0.9），对蛋白相互作用进行筛选，将结果保存成TSV格式，保留文件中node1、node2和Combined score数据并导入Cytoscap3.2.1软件，分析蛋白相互作用网路。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 生物学信息注释数据库（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp，Version 6.8）[12]是支持大规模的基因/靶蛋白列表分析的稳定网络数据库，能够找出最显著富集的生物学注释，被用来进行GO生物过程富集分析和KEGG代谢通路富集分析，以进一步研究六味地黄丸治疗冠心病靶蛋白群的协同作用情况。将药物与冠心病共同靶点导入DAVID数据库，对共同靶点进行GO富集分析和KEGG通路分析，设定阈值P＜0.05，筛选排名靠前的生物过程或通路。

2 结果

2.1 六味地黄丸的活性成分筛选与ADME分析 本研究通过TCMSP数据库对六味地黄丸6味中药已报道的化学成分进行检索，共收集以OB≥30%、DL≥0.18为参数进行初步筛选，结果为熟地黄2个，山茱萸20个，山药16个，茯苓15个，泽泻10个，牡丹皮11个，删除重复成分5个，剔除没有相关信息成分26个，共有43个入血活性成分有良好的口服生物利用度和类药性，见表1。将药物成分及作用靶点导入Cytoscape 3.2.1软件进行可视化分析，见图1。共包括6味中药，43种化学成分，208个潜在靶点。椭圆节点代表靶点，三角形节点代表化学成分，八边形节点代表中药。水绿色、红色、浅蓝色、黄色、绿色、紫色三角形节点分别代表熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、牡丹皮的化学成分。Sitosterol（谷甾醇）是熟地黄、山茱萸、牡丹皮、泽泻4味中药共有的化学成分，stigmasterol（豆甾醇）是熟地黄、山茱萸、山药3味中药共有的化学成分。

图1 六味地黄丸-化合物-靶点相互作用网络

表1 六味地黄丸活性化合物信息

2.2 六味地黄丸中药与冠心病相关靶点网络构建与PPI网络构建 通过TTD、Drugbank、DisGeNET数据库进行检索，获得冠心病相关的靶点996个。将996个疾病靶点与208个药物成分靶点输入Venny 2.1软件绘制韦，得到二者共同靶点85个，A代表冠心病靶点，B代表六味地黄丸潜在靶点，见图2。通过Cytoscape3.2.1软件建立中药-靶点-疾病（traditional Chinese medicine-Target-Disease，C-T-D）网络图，见图3，共包括6味中药，1种疾病，85个靶点，最外层蓝色椭圆形节点代表共同靶点。将85个共同靶点输入STRING数据平台，分析PPI网络9（图4）。该网络由75个节点（10个节点未在网络中）、195条边组成。其中，节点的大小由自由度决定，自由度越大，节点越大。图中节点颜色根据自由度进行设定，颜色从绿色逐渐到红色的改变自由度逐渐增大，同一类的节点颜色相近；边的粗细由介数决定，介数越大，边越粗。其中肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF，度=22）、苏氨酸蛋白激酶（threonine-protein kinase，AKT1，度=16）、白细胞介素 6（Interleukin-6，IL6，度=15）、血管内皮生长因子 A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA，度=14）、（Retinoic acid receptor RXR-alpha，RXRA，度=12）、白细胞介素 8（In－terleukin-8，CXCL8，度=12）、细胞肿瘤抗原 p53（Cellular tumor antigen p53，TP53，度=12）、原癌基因 c-Fos（Proto-oncogene c-Fos，FOS，度=12）等靶蛋白度值大，与其他靶蛋白相互作用强，在网络中发挥了关键作用。由此推测，这些蛋白可能是六味地黄丸治疗冠心病的关键靶蛋白。

图2 冠心病靶点与六味地黄丸靶点Venn图

图3 六味地黄丸与冠心病共同靶点网络图

图4 PPI网络构建

2.3 GO生物学过程富集分析 对六味地黄丸治疗冠心病的相关靶点进行GO生物学过程分析，取P值最小的前20个生物学过程，见表2。GO生物学过程富集分析结果提示，39个靶点参与细胞组分（45.9%），13个靶点参与了信号通路传导（15.3%），8个参与了炎症反应（9.4%），13个靶点参与了RNA聚合酶II启动子调控（15.3%），6个靶点参与了调控血管生成（7.1%），12个靶点参与了DNA复制（14.1%），10个靶点参与了DNA转录（11.8%）等。由此可知，六味地黄丸可能通过调节多种生物过程治疗冠心病。

表2 GO功能富集分析

2.4 六味地黄丸KEGG代谢通路富集分析 利用David平台对筛选出的核心靶点进行KEGG通路富集分析，共获得90条富集结果，其中P＜0.01，与冠心病密切相关的前20条信号通路包括癌症通路、肿瘤坏死因子（TNF）、缺氧诱导因子-1（HIF-1）、雌激素（Estrogen）、toll样受体（TLRs）、磷脂酰肌醇 3-激酶-蛋白激酶（PI3K/Akt）、核因子（NF-κB）、环鸟苷酸依赖的蛋白激酶（cGMP-PKG）、环磷酸腺苷（cAMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路，见表3。这提示六味地黄丸通过作用于多条信号通路、多靶点来治疗冠心病，且这些通路之间存在着复杂的相互作用关系。

表3 靶点通路富集结果

3 讨论

冠心病是冠状动脉由于各种原因发生粥样硬化，导致血管狭窄或闭塞，使心肌缺血缺氧或坏死引起的心脏病，也称缺血性心脏病。其主要危险因素包括高血压、血脂异常、糖尿病、肥胖和超重、吸烟、遗传因素等[3]，近10余年我国冠心病发病率呈明显上升趋势[15]。六味地黄丸是中医临床治疗冠心病的经典方，现代药理研究表明，熟地黄[16]、山药[17]具有抗氧化作用，泽泻具有降血压、降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、保护血管内皮的功能[18]，牡丹皮可以降血糖[19]、保护心血管[20-21]，山茱萸具有降血糖、降血脂的作用[22]，茯苓具有抗炎作用[23]。虽然对六味地黄丸6味中药主要成分的药理学作用已基本明确，但作为复方研究其治疗冠心病的潜在靶点和可能作用机制却鲜见报道。

本研究经过初步筛选得到74个六味地黄丸的生物活性成分，剔除重复和没有相关信息的成分后最终获得43个生物活性成分，对应成分靶点208个，冠心病靶点996个，二者共同靶点85个。通过对85个靶蛋白进行 PPI 分析发现，TNF、AKT1、IL6、VEGFA、RXRA、CXCL8、TP53、FOS 等靶蛋白度值大，说明这些靶蛋白在六味地黄丸治疗冠心病过程中发挥着关键的作用，揭示了六味地黄丸可能通过抗炎、抗氧化、保护血管内皮等多途径来治疗冠心病。

GO富集分析结果显示，六味地黄丸治疗冠心病主要涉及细胞分裂、氧化应激、物质代谢、DNA复制及其转录等生物学过程，蛋白、受体、转录因子、激素、信号分子等多种物质参与，说明六味地黄丸治疗冠心病是一个十分复杂的生物学过程。

KEGG通路富集分析结果显示，六味地黄丸治疗冠心病相关的信号通路包括TNF、HIF-1、PI3K/Akt、Estrogen、TLRs、NF-κB、cGMP-PKG、cAMP、VEGF等。冠心病是一种复杂的慢性炎症性疾病，相关研究表明，炎症反应和免疫反应在冠心病的发生、发展及其预后过程中发挥着极其重要的作用[24]。TNF-α是人体内介导炎症反应、调节细胞和体液免疫的主要细胞因子，其血清水平可以反应机体炎症反应状况，TNF-α与冠心病密切相关[25]，并且血清TNF-α水平与冠心病严重程度密切相关[26]。缺氧诱导因子-1（HIF-1）是低氧状态下组织细胞产生的一种核蛋白，用于维持氧稳态的关键物质[27]，当心肌缺血缺氧时HIF-1α表达增加，促进血管新生，增加心肌血供，对保护心肌具有重要意义[28]。PI3K/Akt信号通路具有广泛的生物学作用，参与调节细胞周期、能量代谢、物质合成等途径，是治疗冠心病、代谢紊乱等多种疾病的重要靶点[29]。此外，PI3K/Akt信号通路可通过抑制糖原合酶激酶-3（glycogen synthase，GSK-3）的活性，增加心肌对葡萄糖的摄取和脂代谢来实现保护心脏的作用[30]，韩军等[31]通过激活 PI3K/Akt信号通路，降低IL-6、TNF-α的活性，减轻炎症反应，保护心肌。Estrogen可以通过调节脂质代谢、抑制炎症反应、减轻心肌缺血损伤及保护血管内膜等方面预防冠心病[32]，雌激素水平降低，心血管疾病和动脉粥样硬化进展的风险在绝经后显著增加[33]。TLRs是一种Ⅰ型跨膜蛋白受体，能够介导天然免疫和获得性免疫反应，其介导炎症反应、调控免疫反应、参与细胞凋亡、斑块稳定性及血管重塑等动脉粥样硬化过程，与冠心病有密切的关系[34]。核因子κB（NF-κB）信号通路与冠心病的发生发展过程密切相关[35]，其在调节动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的炎症反应中起关键作用，曹选超等[36]发现NF-κB高表达的患者可能存在严重的冠脉狭窄，NF-κB信号通路经多种刺激因子诱导后，在下游调节白细胞介素相关基因，凋亡抑制因子等多种基因的表达，不仅参与机体免疫调节、炎症反应及肿瘤等生理病理过程，还参与感染、细胞周期调控、细胞分化及凋亡等[34]。现有的研究结果证明，cGMP-PKG信号通路对于调控心血管系统的正常功能起着重要的作用，其在调节血压、抑制动脉粥样硬化和抗再狭窄、抗血管损伤、调节调节血管平滑肌细胞的收缩和舒张、抑制心肌细胞肥大等方面发挥重要作用[37-38]。cAMP是传递生命信息的重要物质，与心肌细胞的抗缺血、抗氧化及抗损伤能力密切相关，其可增强心肌细胞收缩力，增加心输出量，在一定程度上减轻了心肌缺血[39]。KEGG通路富集结果提示，六味地黄丸可能通过抑制炎症反应、抗氧化应激、抗心肌缺血、保护血管内皮、调节脂代谢等途径治疗冠心病。

综上所述，本研究通过运用网络药理学方法，将网络数据库、药理学等多学科相结合，从系统生物学角度揭示六味地黄丸的中药药理作用，从多角度探索了六味地黄丸治疗冠心病的可能作用机制，预测了六味地黄丸治疗冠心病的潜在靶点和信号通路，为其临床应用及进一步验证其药理作用机制提供理论基础。