姜黄素对A549 肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制 作用及与Keap1/Nrf2 信号通路的关系

金磊，郭洁，刘昊，康云帆*，徐长福

（1 西安医学院第一附属医院心胸外科，2 急诊科，西安710077；3 西安交通大学医学院基础医学院，西安710061）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其疾病发病率和死亡率正在逐年升高，严重威胁着人类生命健康。但是由于肺癌在早期无明显发病症状，因此很大部分患者都是在晚期才能被确诊，从而导致肺癌发生转移，使得患者错过最佳治疗时间[1-3]。肺癌的侵袭和转移是其恶化的标志和特征，也是影响肺癌患者治疗效果并导致患者死亡的最主要原因。肺癌的侵袭、转移是一个极其复杂的过程，该过程中涉及一系列肿瘤侵袭、转移相关的基因或蛋白，一些功能性基因被激活或抑制，另一些基因则表现为缺失或功能失活，或者相互拮抗，从而影响机体免疫系统抗侵袭、转移功能的正常发挥，最终导致肺癌组织的转移[4-6]。

癌基因和抑癌基因与肿瘤的发生、形成有着密切的关系，但是目前关于癌症基因、抑癌基因与肺癌细胞的侵袭和转移之间的关联性仍无明确共识。有研究表明Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelchlike ECH-associated protein 1, Keap1）/核因子E2 相关因子2（nuclear factor-E2- related factor 2, Nrf2）信号通路在肺癌细胞的侵袭、转移过程中发挥重要作用。Nrf2 可以预防肿瘤的发生，而Keap1 是Nrf2的内源性酶抑制剂，对Nrf2 表达水平具有调控作用[7-9]。

姜黄素是中药姜黄的主要活性成分，具有较强的抗癌作用，还可对肺癌达到早期的预防作用。大量研究[10-12]表明姜黄素可通过调节ERK信号通路、mTOR 信号通路等进而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用；此外，姜黄素还可通过调节Rho GTP、β-catenin、capasse-8 等蛋白的表达，发挥对肺癌细胞的增殖、侵袭和转移的抑制作用及诱导肺癌细胞凋亡等作用，并呈现剂量依赖性；但是鲜有文献报道其对Keap1/Nrf2 信号通路的调节作用。因此，本研究采用A549 肺癌细胞，检测姜黄素对于Keap1/Nrf2 信号通路的调节作用和对A549 肺癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响，并分析二者之间的关系。

材料与方法

1 材料与仪器

A549 细胞由中科院上海细胞库提供，姜黄素购买自中国食品药品检定研究院，RPMI1640 细胞培养液购买自美国 Gibco 公司，胎牛血清购买自美国Amresco 公司，一抗Keap1、Nrf2、β-actin 均购买自美国sigma 公司。

3111 型CO2恒温细胞培养器（Thermo 公司，美国），Power Wave XS 型酶标仪（BIO TEK 公司，美国），荧光显微镜（Olympus，日本）。

2 细胞培养

使用含有10%胎牛血清的RPM11640 培养液进行细胞培养，每2d 更换一次细胞培养液，培养条件为37℃，细胞培养箱内CO2浓度为5%；待细胞长满瓶底面积80%、且处于对数期时，加入0.25%胰蛋白酶进行消化、传代，取对数生长期细胞用于实验。

3 MTT 检测细胞增殖

取对数期肺癌A549 细胞，加入RPM11640 培养液，接种于96 孔细胞培养板中，每孔1×104 个细胞，细胞培养48h 贴壁后，将细胞分为4 组，分别加入0、1.25、2.5 和5μmol/L 姜黄素，每个浓度设4 个复孔。于培养终止前4h 每孔加入20μl 的MTT溶液。终止细胞培养时，弃去上清，每孔加入100μl DMSO，于37℃细胞培养箱孵育30min，置于微孔板振荡器振荡20s，采用酶标仪于490nm 处测定各孔吸光度OD 值，计算细胞增殖率。

4 Transwell 实验检测A549 细胞侵袭能力

取对数生长期的A549 细胞，胰酶消化收集细胞，2000r/min 离心5min，洗去培养液后，采用PBS 再次浸洗细胞，干细胞培养基吹打均匀，进行Transwell 实验。取基质胶放置于冰上待其融化后，并用冷的RPMI1640 培养基按照4:1 的比例进行稀释，每孔加入45μl 基质胶，铺匀后放置在细胞培养箱中培养1～2h，并调整细胞浓度为每升5×108，每个小室加入200μl 细胞悬液，即1×105个细胞，并加入不同浓度（0、1.25、2.5 和5μmol/L）的姜黄素，培养48h。然后吸取上室的细胞悬浮液，用4%的多聚甲醛固定15min，再加入结晶紫染色15min。然后用PBS 清洗2 次，用棉棒擦去上室未迁移细胞。显微镜下取 3 个随机视野进行拍照。上述试验重复3 次。

5 Transwell 实验检测A549 细胞迁移能力

取生长状态良好的A549 细胞，用胰酶消化收集细胞后，再用PBS 重复洗去血清的细胞培养液，然后用不含血清的RPMI 640 培养基，将细胞浓度调整为每升2.5×108。小室上室加入200μl 细胞悬液，并加入不同浓度（0、1.25、2.5 和5μmol/L）的姜黄素。同侵袭试验方法处理细胞，培养48h，然后吸取上室的细胞悬浮液，用4%的多聚甲醛固定15min，再加入结晶紫染色15min。然后用PBS 清洗2 次，用棉棒擦去上室未迁移细胞。显微镜下取 3 个随机视野进行拍照。上述试验重复3 次。

6 流式细胞术检测肺癌A549 细胞的凋亡程度

取生长对数期的A549 细胞，采用姜黄素（1.25、2.5和5μmol/L）处理48h后，用磷酸缓冲盐（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞2 次后，采用胰蛋白酶消化、收集细胞，离心后弃去上清后制成细胞悬液，加入5μl 的Annexin V-FITC 染液，混匀后再加入10μl 的碘化丙啶染色，混匀。37℃放置4min，PI染色后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。上述试验重复3 次。

7 Western blot 检测相关蛋白表达

取对数生长期的A549 细胞，加入姜黄素作用24h 后，取3 组细胞，加入细胞裂解液，采用细胞超声破碎仪进行超声破碎，在12000r/min、4℃条件下离心15min，取上清，按照每孔20μg 蛋白样品量上样。采用SDS-PAGE 电泳分离蛋白，100V 恒压转移蛋白至PVDF 膜上，用5%的胎牛血清（BSA）封闭2h，然后分别用Keap1、Nrf2、β-actin 抗体4℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次后加入荧光二抗，孵育2h；弃去液体，TBST 洗涤3 次。用UVI 凝胶成像分析系统测量目的条带的光密度；以β-actin 为内参，以目的蛋白和内参蛋白的光密度比值为目的蛋白的相对表达量。

8 RT-PCR 检测相关蛋白mRNA 的表达

提取3 组细胞的总RNA，并测定其浓度，逆转录后得到cDNA。然后按照试剂盒说明书的具体指示测定Keap1 mRNA 和Nrf2 mRNA 的表达。Nrf2 引物序列（F：3’-GACTCTACCACTGTTCCCAA-5’；R：3’-CCATTCTTATTTCACCGACG-5’）；Keapl 引 物序列（F：3’-TTCAAGCCGCAGTTGCTCA-5’；R：3’-TTAGTCACCAGCGGGACG-5’）；β-actin 引 物序列（F：3’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-5’；R：3’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-5’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应条件为：90℃变性20min 后，然后92℃ 45s，56℃ 32s，72℃ 55s，共42 个循环。取4μl 进行6%的聚丙烯凝胶电泳。电泳结束将凝胶浸泡在0.5μg/ml 溴化乙锭（EB）溶液中染色，后应用LAPHA 凝胶成像系统对Keapl 和Nrf2 电泳条带进行光密度扫描。由计算机计算出各自积分吸光度值，以Keapl 和Nrf2 与β-actin 的光密度比值（Keapl/β-actin、Nrf2/β-actin）表示相对强度。

9 统计与分析

本研究所有实验均进行3 次重复性实验，实验数据采用均数±标准差表示；所有数据均采用SPSS 22.0 进行统计分析，使用GraphPad Prism 6 制图。多组间比较均采用单因素方差分析，以P＜0.05 为具有统计学意义。

结 果

1 姜黄素抑制A549 细胞增殖

MTT 实验检测所示，0、1.25、2.5 和5μmol/L浓度的姜黄素作用于肺癌A549 细胞后，其增殖力较未用姜黄素处理者明显降低，并且随着姜黄素浓度的增加，细胞增殖力降低逐渐明显，呈现出明显的剂量依赖性（图1）。

图1 MTT 法检测不同浓度姜黄素对A549 细胞增殖力的影响。与对照组相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01。与1.25μmol/L 组相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01。与2.5μmol/L 组相比：&，0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig. 1 MTT assay for the effect of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on cell proliferation. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25μmol/L group, #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5μmol/L group: &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

2 姜黄素抑制A549 细胞的侵袭与迁移

Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力结果显示，姜黄素（1.25、2.5 和5 μmol/L）能够明显抑制A549 细胞的侵袭，其48h 的抑制率分别为52.63%±6.32%、69.77%±7.58%和81.47%±7.57%；姜黄素（1.25、2.5 和5μmol/L）能够有效降低A549 细胞的迁移能力，其48h的抑制率分别为（41.58±8.47%），58.62%±8.97%，65.37±7.84%。

3 姜黄素促进肺癌A549 细胞凋亡

为了探究姜黄素是否能够促进肺癌A549 细胞的凋亡，采用流式细胞术对姜黄素处理48h后的细胞进行Annexin V-PI 双染凋亡检测。结果显示，与对照组相比，随着姜黄素浓度（1.25、2.5 和5μmol/L）不断增加，肺癌A549 细胞的凋亡程度呈现上升趋势，与浓度呈现正相关，表明姜黄素能够促进肺癌A549 细胞的凋亡。

图2 不同浓度（0、1.25、2.5、5μmol/L）姜黄素对A549 细胞侵袭与迁移影响的Transwell 实验分析。A，代表性Transwell 实验结果。B，姜黄素对A549 细胞侵袭影响的统计学分析。C，姜黄素对A549 细胞迁移影响的统计学分析。与对照组相比：*， 0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01。与1.25 μmol/L 组相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01。与2.5 μmol/L 组相比：&，0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig. 2 Transwell assay for effects of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on invasion and migration of A549 cells. A, representative results of Transwell assay. B, statistical analysis for effect of curcumin on invasion of A549 cells. C, statistical analysis for effect of curcumin on migration of A549 cells. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25μmol/L group: #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5μmol/L group: &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

图3 不同浓度（0、1.25、2.5、5μmol/L）姜黄素对肺癌A549 细胞凋亡程度影响的流式细胞术分析。A，代表性流式细胞术分析结果。B，统计学分析。与对照组相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01。与1.25μmol/L 组相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01。与2.5μmol/L 组相比：&, 0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig.3 Flow cytometry analysis for effect of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on apoptosis of lung cancer A549 cells. A, representative results of flow cytometry analysis. B, statistical analysis. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25 μmol/L group, #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5 μmol/L group, &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

4 姜黄素降低A549 细胞Keap1 和Nrf2 水平

Western blot 实验显示，不同浓度的姜黄素处理后的A549细胞，随着药物浓度的增加，各组中Keap1和Nrf2 的蛋白表达量在A549 细胞中显著性降低，表明姜黄素能够显著性调节A549 细胞中Keap1 和Nrf2 的蛋白表达，对于Keap1/Nrf2 信号通路具有抑制作用（图4）。

图4 不同浓度（0、1.25、2.5、5μmol/L）姜黄素对肺癌A549 细胞Keap1 和Nrf2 水平影响的Western blot 检测。A，代表性Western blot 结果。B，统计学分析。与对照组相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；与1.25μmol/L 组相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01；与2.5μmoL/L组相比：&，0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig.4 Western blot detection for effect of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on levels of Keap1 and Nrf2 in A549 cells. A, representative results of Western blot. B, statistical analysis. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25μmol/L group, #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5μmoL/L group, &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

5 姜黄素抑制A549 细胞中Keap1 mRNA 和Nrf2 mRNA 的表达

RT-PCR 检测显示，姜黄素处理后，A549 细胞中Keap1 mRNA和Nrf2 mRNA水平均较空白组显著性降低，与姜黄素浓度呈现负相关，表明姜黄素能在转录水平显著抑制A549 细胞中Keap1 和Nrf2 的表达。

图5 不同浓度（0、1.25、2.5、5μmol/L）姜黄素对肺癌A549 细胞Keap1 和Nrf2 mRNA 表达影响的RT-PCR 检测。A，代表性RT-PCR 结果。B，统计学分析。与对照组相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；与1.25μmol/L 组相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01；与2.5μmoL/L组相比：&，0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig.5 RT-PCR assay for effect of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on mRNA levels of Keap1 and Nrf2 in A549 cells. A, representative results of RT-PCR. B, statistical analysis. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25μmol/L group, #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5μmoL/L group, &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

结 论

肺癌细胞的侵袭和转移是其疾病病程恶化的重要标志和特征，也是影响患者治疗效果、并导致患者死亡的主要原因。然而肺癌细胞的侵袭和转移是一个非常复杂的病理过程，涉及多种蛋白、基因的调节，是一种细胞增殖和凋亡均发生异常的疾病[13-15]。从基因和蛋白水平来解释肺癌的侵袭和转移，对于肺癌的临床新药研发、预防和治疗具有重要意义。姜黄素作为中药姜黄的主要活性成分，多项研究表明其具有广泛的抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种药理活性，且对于多种肿瘤的耐药作用均具有逆转作用[16-18]。本研究基于肺癌A549 细胞，探究姜黄素对A549 细胞迁移、侵袭的抑制作用及其调节机制，实验结果显示姜黄素能够显著性抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并能够促进肺癌细胞发生凋亡。

Keap1/Nrf2 信号通路与肿瘤细胞的耐药性具有密切关系。Keap1 蛋白是Nrf2 的关键性调节基因，也是调节Nrf2 介导的抗氧化反应的“分子开关”[19,20]。正常情况下，Nrf2 位于细胞质中，Keap1 在细胞质中能够与Nrf2 结合形成Keap1-Nrf2 复合物，使Nrf2在胞质内持续泛素化，并进一步被蛋白降解，从而使得Nrf2 从胞质转移到胞内的过程被抑制。既往研究表明，Keap1/Nrf2 信号通路在抗肿瘤的研究中发挥者重要作用。在许多肿瘤细胞中，Nrf2 蛋白均处于过表达状态，表明Nrf2 蛋白对于肿瘤的发生起着重要作用[21-23]。本研究通过测定Keap1 和Nrf2 蛋白及其mRNA 水平，证明姜黄素能够显著抑制Keap1/Nrf2信号通路蛋白的表达，表明姜黄素对于Keap1/Nrf2信号通路活性具有抑制作用作用。

综上所述，本研究通过增殖、侵袭和迁移实验证实姜黄素能够有效抑制肺癌A549 细胞的增殖、侵袭和迁移，进而影响肺癌细胞的转移能力，并能够促进肺癌细胞发生凋亡。姜黄素对A549 细胞的这些作用可能是通过抑制Keap1/Nrf2 信号通路蛋白表达而抑制该信号通路活性实现的。