靶向肝星状细胞治疗肝纤维化的纳米递送系统研究进展

靳雯臻 谭晓川 文瑾 宋辉 张宇佳 郑稳生

[摘要] 肝纤维化是严重威胁人类健康的慢性疾病。由于药物递送缺乏靶向性，肝纤维化治疗效果有限且常伴随着副作用的发生。为提高肝纤维化治疗效果，使用纳米载体达到靶向递送的研究越来越广泛。本文从靶向目标及载体种类方面综述了近年来靶向肝星状细胞治疗肝纤维化的纳米递送载体的研究进展，提供了肝纤维化靶向治疗的新思路，为实现高效治疗肝纤维化提供理论参考。

[关键词] 肝纤维化;肝星状细胞;纳米载体;靶向递送

[中图分类号] R512.62          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（c）-0034-04

[Abstract] Hepatic fibrosis， a chronic disease， proposes a serious threat to human health. The low efficiency and occurrence of side effects are often contributed by the lack of liver specificity. In order to improve the therapeutic effect of liver fibrosis，research about the use of nanocarriers to achieve targeted delivery has become more and more extensive. This review summarizes the nano-delivery carriers targeting hepatic stellate cells that have been applied in the treatment of liver fibrosis in recent years from the type of carriers and target receptors，which offer a new idea to treat liver fibrosis and serve as the basis of designing safe and effective drug delivery systems for liber fibrosis.

[Key words] Hepatic fibrosis; Hepatic stellate cells; Nanocarrier; Target delivery

肝是人體最大的实质器官，在人体胆固醇代谢和肠道脂质吸收中发挥着极为重要的作用。慢性肝损伤包括病毒性肝炎感染、酒精滥用、脂肪性肝炎等均可引起肝脏炎性反应并延缓肝脏的伤口愈合过程，进而导致肝纤维化。肝纤维化的特征表现为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积累和纤维瘢痕形成。纤维瘢痕破坏正常的肝脏结构并损伤肝细胞，阻碍肝脏正常生理功能的发挥，最终导致肝功能衰竭。然而，目前为止，除了去除潜在的病因和肝移植之外，仍没有可用于肝纤维化治疗的有效手段。

肝纤维化是由门静脉成纤维细胞、骨髓衍生成纤维细胞、间质细胞和活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）介导的ECM（主要是Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原）合成和降解不平衡的结果。作为ECM的主要来源，肌成纤维细胞的活化和增殖在纤维化中是极为重要的。不同病因引起的肝纤维化中肌成纤维细胞的来源可能是不同的，但在肝纤维化的最后阶段，HSC都将被活化并最终成为肌成纤维细胞群体[1]的最大贡献者。已有研究显示HSC的消耗会显著减轻模型小鼠中的肝纤维化和肝损伤程度。

HSC定位于肝细胞和窦状内皮细胞之间的窦周间隙中，占正常肝脏中肝细胞数量的5%～8%[2]。正常肝脏中HSC是非实质的静止细胞，是体内维生素A（Vitamin A，VA）储存的主要部位[3]。在纤维化刺激如转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）和血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）水平增加的影响下，VA水解提供能量，HSC活化为肌成纤维细胞并转移至损伤部位，并在此处表达纤维化相关产物如波形蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）[4]。缺乏VA储备的HSC同样具有活化并转化为肌成纤维细胞的能力。HSC聚集在受损组织周围，并分泌化学物质如单核细胞趋化蛋白，进一步吸引活化的HSC并促进单核细胞和白细胞的募集。HSC活化的另一个特点是细胞生长周期激活，导致HSC增殖且肝脏中肌成纤维细胞数量增加[5]。加速ECM产生的同时，HSC通过分泌基质金属蛋白酶组织抑制剂抑制ECM的降解。多种因素的共同作用下，ECM在细胞外大量积累引起纤维化发生。

活化的HSC细胞表面表达或高表达多种受体，如甘露糖-6-磷酸/胰岛素样（mannose-6-phosphate/insulinlike growth factor Ⅱ，M6P/IGF Ⅱ）受体，整联蛋白（integrin），血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptors，PDGFR），视黄醇结合蛋白（retinol binding protein，RBP）等。近年来纳米载体发展迅速，利用制剂方法构建靶向HSC的纳米载体，递送药物抑制HSC活化是治疗肝纤维化极有前景的方法。现将研究进展综述如下：

1 靶向M6P/IGF Ⅱ受体

M6P/IGF Ⅱ受体是一种多功能受体，肝纤维化期间，M6P/IGF Ⅱ受体在HSC表面过表达，并能促进TGF-β活化，而TGF-β是刺激HSC产生胶原的强效细胞因子。M6P/IGF Ⅱ受体总数的10%～20%存在于细胞表面[6]。甘露糖-6-磷酸修饰的人血清白蛋白（M6P-modified-human serum albumin，M6P-HSA）对M6P/IGF Ⅱ受体具有选择性，可在活化的HSC中积累。HSC靶向递送中，关于M6P/IGF Ⅱ受体的研究最为深入，大量数据均表明M6P-HSA与其结合靶向递送的有效性。目前M6P-HSA已作为己酮可可碱、多柔比星、胶霉毒素[14]等药物的靶向递送。利用M6P/IGF Ⅱ受体与M6P-HSA的特异性识别并结合，以其为靶标，通过构建的纳米载体将药物选择性地递送至HSC，实现肝纤维化的靶向给药。

脂质体是肝纤维化靶向递送的主要载体。一项研究构建证明将M6P-HSA偶联至脂质体能极大程度地增强其HSC结合摄取率。该研究中发现M6P-HSA修饰的脂质体静脉注射10 min后即有90%的载体从体循环中清除靶向至HSC[8]，保证了其能将负载的药物高效地递送至HSC中。Luk等[9]的研究证明，将M6P-HSA偶联到载有18β-甘草次酸的脂质体表面能显著减弱模型大鼠的纤维化程度。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ可阻止PDGF介导的增殖和迁移，抑制α-SMA的表达。一项研究以薄膜水化法构建了过氧化物酶体增殖物激活受体-γ配体负载的脂质体并偶联以M6P-HSA。静脉给药后发现，模型小鼠纤维化症状明显减轻，药物分布及药效学数据表明修饰后肝脏摄取增加2.61倍[10]。M6P-HSA修饰的脂质体还可将灭活病毒靶向递送至HSC[11]。研究者以该载体负载包含质粒DNA的日本灭活病毒获得粒径为200 nm的脂质体，M6P-HSA保证了载体的HSC靶向，脂质体与病毒包膜的融合则使灭活病毒颗粒在HSC中积累成为现实。这项研究的重要意义在于其有潜力联合递送基因编辑系统至HSC，使得肝纤维化的治疗进入新的领域。

胶束是另一个常见载体。Hedgehog信号可调节胆汁淤积性肝脏缺血再灌注期间的肝损伤，使用Smo抑制剂环巴胺阻断其通路能有效发挥肝保护作用。肝纤维化发生时，反复的肝损伤会造成肝实质细胞增加分泌生长因子及Hedgehog配体，进而导致HSC转化为活性肌成纤维细胞。环巴胺GDC-0449在肝纤维化大鼠中可通过降低HSC活化和抑制上皮至间质的转化减弱肝纤维化的程度。有研究[12]构建能生物降解的长循环聚合物胶束并缀合以M6P。在给未修饰载药胶束后，正常及模型大鼠中主药均快速清除，表现出相似的血浆清除率和AUC。而静脉给靶向载体后GDC-0449表现出更高肝积累并达到最大。这表明经M6P修饰的胶束可用作肝纤维化治疗的理想递送载体。

新型纳米粒也越来越引起研究者的关注。已有研究证明，人血清和牛血清白蛋白纳米粒能靶向HSC治疗肝纤维化。雄性Wistar大鼠体内外研究均表明M6P修饰的人血清白蛋白纳米粒是一种有效的纳米载体，能特异性靶向HSC并利用免疫反应发挥纤维化治疗作用[13]。另一组研究使用M6P修饰人血清蛋白纳米粒成功将多柔比星递送至HSC，体内外研究均显示出肝纤维化标志物的减少。

2 靶向整联蛋白

整联蛋白是许多器官纤维化的中枢调节剂。所有整联蛋白在其配体中有共同的基序，其中RGD（Arg-Gly-Asp）序列研究最为广泛。RGD易于被叠氮化物、胺或其他氨基酸和荧光基团等修饰而具有不同的特异性[14]，RGD修饰的白蛋白或脂质体能有效靶向递送药物至HSC。

Chai等[15]制備了RGD修饰的氧化苦参碱脂质体，通过靶向HSC抑制其活性并诱导细胞凋亡发挥抗纤维化效果。数据显示，给RGD修饰脂质体治疗的纤维化大鼠的血清碱性磷酸酶的能力增加显著，纤维化程度明显减轻。干扰素α具有抗纤维化作用，皮下给药可有效降低模型大鼠的基因表达及Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积。有研究构建了RGD修饰空间稳定脂质体。RGD与活化的HSC表现出高亲和力，在HSC中的积累量高达未标记脂质体的10倍。HSC增殖受到抑制，Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达量明显降低，且注射靶向载体的模型大鼠血清谷丙转氨酶和总胆红素水平降低。结果表明，RGD标记脂质体通过受体介导的内吞作用被活化的HSC选择性吸收，并且包封脂质体制剂中的干扰素在体外显示出对HSC增殖的更好抑制。该脂质体制剂代表了一种靶向药物载体用于治疗肝纤维化的新方法，并且它可能具有潜在的临床应用[16]。

聚合物囊泡是由两亲性片段组成的自组装载体，可负载亲水及疏水性药物。聚合物囊泡的理化性质如粒径、载药量、表面改性以及稳定性等均可通过嵌段共聚物的长度、化学性质及功能的改善在较大范围内进行调整。氧化苦参碱通过抑制HSC增殖，降低胶原表达量和纠正细胞因子异常等发挥抗纤维化作用。Yang等[17]构建了RGD修饰的氧化苦参碱囊泡，该载体平均粒径95 nm，载药量为6.8%，表现出慢的释放速度和持久的释放时间。该载体靶向性良好，显著抑制HSC增殖，最大程度缓解模型动物肝纤维化程度。

3 靶向视黄醇结合蛋白

RBP是极有潜力的靶向结构，它负责VA的摄取与储存，肝星状细胞储存了高达全身80%的VA[18]。VA可以与HSC表面的RBP特异性结合，因此VA修饰的纳米粒具有HSC特异性，通过两者的结合可实现药物靶向HSC递送。

VA偶联的脂质体有效改善了缬沙坦的渗透性。口服后荧光追踪表明该载体表现出极好的肝靶向性且持续时间长达6 d，HSC免疫荧光染色结果证明载体在HSC中的靶向以及良好的核吸收[19]。有学者[20]制备了VA偶联的伊马替尼负载脂质体。活体动物成像结果显示该脂质体的肝脏积累，并证实其HSC靶向性。静脉给药后，修饰的脂质体表现出比常规伊马替尼高13.5倍的肝脏积累和更少的不良反应，肝功检查以及肝毒性评估也显示出羟脯氨酸，TGF-β和基质金属蛋白酶-2的正常化和明显的抗纤维化作用。另一项研究[21]以VA偶联的脂质体为载体负载肝细胞生长因子基因并将其特异性地递送至HSC。细胞研究发现纤维化标志物TGF-β显著减少，而模型动物中αSMA和胶原沉积减少，表明该载体良好的靶向递送能力。脂质体靶向递送核酸目前已进入临床阶段，VA修饰的siRNA负载脂质体已经开始Ⅰ期临床试验。在该研究中，VA偶联的脂质体将siRNA成功递送至HSC，抑制了胶原的分泌，减轻了纤维化程度[22]。

化学基因疗法，即将化学与基因药物联合递送以达到协同效应，在肝纤维化治疗中仍是尚待开发的领域。水飞蓟宾和小干扰RNA-siCol1α1均可通过抑制Ⅰ型胶原mRNA的表达而用于肝纤维化的治疗，两者的组合递送可实现更好的肝重塑效果。Qiao等[23]构建聚合物胶束并以VA修饰。所得共负载胶束表面带正电，体外表现出极低的细胞毒性和溶血性，在小鼠体内则表现出良好的耐受性。数据表明，经VA修饰的胶束更有效的积聚在肝脏及活化HSC中，Ⅰ型胶原沉积量减少和肝纤维化的程度减轻更明显。且与单负载相比，共负载减少Ⅰ型胶原产生改善肝纤维化的效果更明显。肝纤维化涉及多种信号通路，单一的治疗药物效果有限，而该实验提供了一种将化学药物与基因治疗相结合的新思路，利用纳米载体将两者共递送实现更加理想的治疗效果，为肝纤维化治疗开辟了新方向。

4 靶向PDGFR

PDGF是由兩条相关多肽链通过二硫键连接而成的二聚体。PDGF-B和PDGF-D是刺激HSC增殖和细胞内信号传导的最有效因子[24]。PDGF信号传导具有调节细胞增殖和活化、血管生成、细胞迁移和刺激结缔组织基质的主要组分合成的作用。PDGF表达量在急性慢性肝损伤后均增加且PDGF及其受体亚单位表达与纤维化程度高度相关。

环肽pPB对PDGFR-β具有特异性识别能力。以pPB修饰空间稳定脂质体并负载γ-干扰素。体外试验证明载体能被活化的HSC吸收并完全内化，靶向载体的HSC抑制率为非靶向载体和游离药物的7.24、2.95倍。体内数据显示载体主要积聚在肝脏中定位于活化HSC中，并且具有比游离γ-干扰素更长的半衰期[25]。pPB修饰脂质体的包封延长了γ-干扰素的半衰期，并提高其体内HSC的靶向效率。

5 结论与展望

肝纤维化是对几乎所有形式的慢性肝损伤的常见瘢痕形成反应，特点是HSC的激活和胶原蛋白尤其是Ⅰ型胶原在肝的过度积累。尽管对肝纤维化发生发展的机制已经有了较好的理解，但临床尚未有药物可以有效地治疗肝纤维化。一个限制性因素是药物不能特异性靶向递送至HSC并且常对实质细胞产生毒性作用[26]，需要精准用药。此外，肝纤维化是一个涉及多种信号通路的复杂疾病，单一的药物治疗抗纤维化作用有限。为了增强治疗效果，必须给予患者非常高的剂量，这导致非靶组织或细胞中更多的副作用。药物联合应用和靶向递送将会是未来肝纤维化治疗的研究方向。

纳米载体递送治疗肝纤维化在动物模型中表现出广阔的前景。脂质体、胶束等载体在药物递送中应用广泛，对载体进行特异性修饰后达到肝靶向递送已显现出巨大的潜力。纳米载体的发展为肝纤维化的预防和治疗提供了新的思路和方向。随着研究的深入，靶向递送的纳米治疗也快速更新，并有望成为肝纤维化预防和治疗的主要措施。

[参考文献]

[1]  Iwaisako K，Jiang C，Zhang M，et al. Origin of myofibroblasts in the fibrotic liver in mice [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（32）：3297-3305.

[2]  Blouin A，Bolender RP，Weibel ER. Distribution of organelles and membranes between hepatocytes and nonhepatocytes in the rat liver parenchyma. A stereological study [J]. J Cell Biol，2013，72（2）：441-455.

[3]  Kisseleva T，Brenner DA. Hepatic stellate cells and the reversal of fibrosis [J]. J Gastroenterol Hepatol，2010，21（s3）：S84-S87.

[4]  Xu T，Ni MM，XingLi，et al. NLRC5 regulates TGF-β1-induced proliferation and activation of hepatic stellate cells during hepatic fibrosis [J]. Int J Biochem Cell Biol，2016，70：92-104，447-457.

[5]  Hernandezgea V，Friedman SL. Pathogenesis of Liver Fibrosis [J]. Annu Rev Pathol，2011，6（1）：425-456.

[6]  York SJ，Arneson LS，Gregory WT，et al. The rate of internalization of the mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor Ⅱ receptor is enhanced by multivalent ligand binding [J]. J Biol Chem，1999，274（2）：1164-1171.

[7]  Hagens WI，Olinga P，Meijer DKF，et al. Gliotoxin non-selectively induces apoptosis in fibrotic and normal livers [J]. Liver Int，2010，26（2）：232-239.

[8]  Adrian JE，Kamps JAAM，Scherphof GL，et al. A novel lipid-based drug carrier targeted to the non-parenchymal cells， including hepatic stellate cells，in the fibrotic livers of bile duct ligated rats [J]. Biochim Biophys Acta，2007，1768（6）：1430-1439.

[9]  Luk JM，Zhang QS，Lee NP，et al. Hepatic stellate cell-targeted delivery of M6P-HSA-glycyrrhetinic acid attenuates hepatic fibrogenesis in a bile duct ligation rat model [J]. Liver Int，2010，27（4）：548-557.

[10]  Zingarelli B，Cook JA. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a new therapeutic target in sepsis and inflammation [J]. Shock，2005，23（5）：393-399.

[11]  Adrian JE，Kamps JA，Poelstra K，et al. Delivery of viral vectors to hepatic stellate cells in fibrotic livers using HVJ envelopes fused with targeted liposomes [J]. J Drug Target，2007，15（1）：75-82.

[12]  Kumar V，Mondal G，Dutta R，et al. Co-delivery of small molecule hedgehog inhibitor and miRNA for treating liver fibrosis [J]. Biomaterials，2016，76：144-156.

[13]  Beljaars L，Olinga P，Molema G，et al. Characteristics of the hepatic stellate cell-selective carrier mannose 6-phosphate modified albumin [M6P（28）-HSA] [J]. Liver Int，2010，21（5）：320-328.

[14]  Cao Q，Han X，Li L. Enhancement of the efficiency of magnetic targeting for drug delivery： Development and evaluation of magnet system [J]. J Magn Magn Mater，2011， 323（15）：1919-1924.

[15]  Chai NL，Fu Q，Shi H，et al. Oxymatrine liposome attenuates hepatic fibrosis via targeting hepatic stellate cells [J]. World J Gastroenterol，2012，18（31）：4199-4206.

[16]  Du SL，Pan H，Lu WY，et al. Cyclic Arg-Gly-Asp peptide-labeled liposomes for targeting drug therapy of hepatic fibrosis in rats [J]. J Pharmacol Exp Ther，2015，322（2）：560-568.

[17]  Yang J，Hou Y，Ji G，et al. Targeted delivery of the RGD-labeled biodegradable polymersomes loaded with the hydrophilic drug oxymatrine on cultured hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats [J]. Eur J Pharm Sci，2014， 52（1）：180-190.

[18]  Blaner WS，Yang L，Brun PJ，et al. Vitamin A Absorption，Storage and Mobilization [J]. Subcell Biochem，2016， 81：95-125.

[19]  Elmezayen NS，Elhadidy WF，Elrefaie WM，et al. Oral vitamin-A-coupled valsartan nanomedicine： High hepatic stellate cell receptors accessibility and prolonged enterohepatic residence [J]. J Control Release，2018，283：32-44.

[20]  Elmezayen NS，Elhadidy WF，Elrefaie WM，et al. Hepatic stellate cell-targeted imatinib nanomedicine versus conventional imatinib：A novel strategy with potent efficacy in experimental liver fibrosis [J]. J Control Release，2017，266：226-237.

[21]  Narmada BC，Kang Y，Venkatraman L，et al. Hepatic Stellate Cell–Targeted Delivery of Hepatocyte Growth Factor Transgene via Bile Duct Infusion Enhances Its Expression at Fibrotic Foci to Regress Dimethylnitrosamine-Induced Liver Fibrosis [J]. Hum Gene Ther，2013，24（5）：508-519.

[22]  Bansal R，Nagórniewicz B，Prakash J. Clinical Advancements in the Targeted Therapies against Liver Fibrosis [J]. Mediators Inflamm，2016，2016（3）：1-16.

[23]  Qiao JB，Fan QQ，Xing L，et al. Vitamin A-decorated biocompatible micelles for chemogene therapy of liver fibrosis [J]. J Control Release，2018，283：113-125.

[24]  Pinzani M，Gesualdo L，Sabbah GM，et al. Effects of platelet-derived growth factor and other polypeptide mitogens on DNA synthesis and growth of cultured rat liver fat-storing cells [J]. J Clin Invest，1989，84（6）：1786-1793.

[25]  Li F，Li QH，Wang JY，et al. Effects of interferon-gamma liposomes targeted to platelet-derived growth factor receptor–beta on hepatic fibrosis in rats [J]. J Control Release，2012，159（2）：261-270.

[26]  Higashi T，Friedman SL，Hoshida Y. Hepatic stellate cells as key target in liver fibrosis [J]. Adv Drug Deliv Rev，2017， 121：27-42.

（收稿日期：2018-08-30  本文編辑：苏   畅）