Genistein对大鼠卵巢颗粒细胞CREB基因表达的影响

温海霞 肖晓辉 孟毅 程丹玲

[摘要] 目的 观察Genistein对大鼠卵巢颗粒细胞cAMP反应元件结合蛋白（CREB）基因表达的影响及其与雌激素受体（ER）的关系。 方法 分离大鼠卵巢颗粒细胞进行培养，分别给予Genistein（0.1、1、5、10、100 μmol/L）及ER阻断剂ICI182，780（1 μmol/L）处理24 h后，采用RT-PCR检测CREB mRNA的表达。 结果 1、5和10 μmol/L Genistein组CREB mRNA表达显著高于空白对照组（P < 0.05或P < 0.01）。细胞预先加入ER阻断剂ICI182，780处理30 min后，再加入1、10 μmol/L Genistein处理24 h组，CREB mRNA表达与1、10 μmol/L Genistein组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。 结论 1～10 μmol/L的Genistein可上調大鼠卵巢颗粒细胞CREB基因的表达，但可能并非通过ER介导。

[关键词] Genistein;卵巢颗粒细胞;cAMP反应元件结合蛋白;雌激素受体

[中图分类号] R339.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（c）-0019-03

[Abstract] Objective To investigate the effects of Genistein on the gene expression of cAMP response element binding protein （CREB） in the rats ovarian granulosa cells and the relationship with the estrogen receptor （ER）. Methods The ovarian granulosa cells from female rat were isolated and collected， incubated and treated with Genistein （0.1， 1， 5， 10， 100 μmol/L） and ER blocker ICI182， 780 （1 μmol/L） for 24 h. Then the CREB mRNA expression level was assessed by RT-PCR. Results Compared with the control group， the expression of CREB mRNA of 1， 5 and 10 μmol/L Genistein group was higher （P < 0.05 or P < 0.01）. After the cells pretreated with ER blocker ICI182， 780 for 30 min， 1， 10 mol/L Genistein added and pretreated 24 h group， the expression of CREB mRNA had no significant difference compared with the 1， 10 μmol/L Genistein group （P > 0.05）. Conclusion 1-10 μmol/L Genistein could up-regulate the expression of CREB gene in the rats ovarian granulosa cells. The molecular mechanism of Genistein effect on the CREB gene expression may not be mediated by ER.

[Key words] Genistein; Ovarian granulosa cells; cAMP response element binding protein; Estrogen receptor

Genistein是一种植物雌激素，具有强抗氧化性和多重肿瘤抑制效应[1-3]，并能双向调节雌激素受体（estrogen receptor，ER）[4-6]。研究[7]发现，Genistein可诱导芳香化酶基因转录，增加局部雌激素合成。在卵巢颗粒细胞，芳香化酶的活性主要受卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）调节[8]，后者通过FSHR-AC-cAMP-PKA途径，激活cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB），进而始动芳香化酶基因转录[9-10]。我们在前期研究发现，一定浓度的Genistein可影响卵巢颗粒细胞芳香化酶基因表达，但是否经由ER介导，并进而影响CREB转录，目前尚不清楚。因此，本研究采用细胞培养、逆转录PCR等分子生物学技术，观察Genistein对雌性大鼠的卵巢中颗粒细胞CREB基因表达的影响，进一步使用ER-α的阻断剂ICI182，780观察Genistein上述作用与ER的关系，初步揭示Genistein调节卵巢局部内分泌功能的分子机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

健康雌性SD大鼠，25～28 d龄，体重60～80 g，哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供，自动控制光照，自由摄食、饮水。实验动物使用许可证号：（黑）2013-002。

1.2 主要仪器

PCR扩增仪（PTC-100型，美国MJ.Research公司）;GIS凝胶成像及分析系统（上海天能生物公司）。

1.3 主要试剂

Genistein（美国Sigma公司）;17β-雌二醇（17β-E2，美国Sigma）;ICI182，780（美国Sigma）;小牛血清白蛋白（BSA，美国Sigma）;孕马血清促性腺激素（PMSG，天津华孚高新生物技术公司）;Trizol（美国Invitrogen公司）;BcaBESTTM RNA PCR试剂盒（大连Takara Nilestriol公司）;PCR引物（上海英骏生物有限公司）。

1.4 实验分组及处理

未成年大鼠颈后皮下注射PMSG，60 U/只，48 h后急性断头处死，立刻剥离出双侧卵巢，针刺卵泡充分释放出颗粒细胞，过滤、冲洗、离心后，用新鲜配制的DMEM/F12培养液（含青、链霉素）调整细胞浓度至3×105/mL。细胞悬液分装至6孔培养板，37℃的5%CO2培养箱中培养48 h后，分别加入不同浓度Genistein（GEN）、17β-E2及ICI182，780（ICI）等因素處理。

实验共分9组：①空白对照组（0 μmol/L GEN组）;②0.1 μmol/L GEN组;③1 μmol/L GEN组;④5 μmol/L GEN组;⑤10 μmol/L GEN组;⑥100 μmol/L GEN组;⑦17β-E2（10 nmol/L）组;⑧1 μmol/L ICI预处理30 min后加1 μmol/L GEN组;⑨1 μmol/L ICI预处理30 min后加10 μmol/L GEN组。因素处理细胞24 h后，收集至1.5 mL Eppendorf管中，-70℃保存，用于总RNA提取和RT-PCR。见表1。

1.5 实验方法

利用RT-PCR技术检测CREB mRNA表达。先使用Trizol提取细胞总的RNA，按PCR试剂盒说明书逆转录。利用Gene Runner软件进行设计引物，β-actin作为内参。PCR反应的扩增条件为94℃预变性1 min，94℃变性4 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环次数为38次，72℃充分延伸10 min。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统拍照并进行条带灰度分析，以目标基因CREB与内参β-actin灰度的比值代表CREB的相对表达量。实验重复3次。CREB及β-actin的引物序列及产物长度见表2。

1.6 统计学方法

采用SPSS 11.5对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠卵巢颗粒细胞CREB mRNA的表达情况

通过逆转录PCR电泳及成像结果显示，实验各组均扩增出一条CREB片段，大小约256 bp。

2.2 Genistein对大鼠卵巢颗粒细胞CREB mRNA表达的影响

电泳条带的灰度分析显示：1、5和10 μmol/L Genistein组及10 nmol/L 17β-E2组CREB mRNA表达量与空白对照组比较均明显增加（P < 0.05或P < 0.01）。细胞预先加入ER阻断剂ICI182，780培养30 min后，再分别加入1 μmol/L和10 μmol/L Genistein继续处理细胞24 h，H组与D组、I组和F组比较，CREB mRNA表达水平差异均无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

近年来发现，Genistein可增加人卵巢癌细胞A2780对顺铂等常规化疗药物的敏感性[10]，并能调节雌性哺乳动物内分泌活动[11-13]。本研究[14-16]前期在体实验也发现，Genistein可上调衰老大鼠卵巢ER-α表达，并促进雌激素生成关键酶芳香化酶基因表达，但具体机制尚不十分清楚。

CREB是细胞内的第三信使，定位于细胞核内，作为一个重要的转录因子，可影响芳香化酶基因转录水平[17]。研究[18]发现，Genistein能够通过激活PKC和P38而促使DNA结合FSHR下游因子CREB和芳香化酶基因的转录。本研究观察了Genistein对大鼠卵巢颗粒细胞CREB mRNA表达的影响，发现1、5、10 μmol/L Genistein作用颗粒细胞24 h，均可增加CREB mRNA表达，并且这种作用不被ER阻断剂ICI182，780所抑制，提示Genistein对芳香化酶基因上游调控因子CREB的激活可能并非通过ER介导。

研究[20]发现，Genistein可影响子宫内膜芳香化酶启动子Ⅰ的表达，是通过一种新型膜性G蛋白偶联雌激素受体（G protein coupled estrogen receptor，GPER）介导，与经典ER无关。那么Genistein影响卵巢芳香化酶及上游CREB的表达是否经由GPER介导，尚需进一步研究。

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（收稿日期：2016-10-21  本文编辑：金   虹）