溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜中IL-35与IL-17的表达及意义

赵君雅 李威 李薇 孙鸿宇 李欣 官杰

[摘要] 目的 探討白介素-17（IL-17）、IL-35在溃疡性结肠炎（UC）大鼠肠黏膜中的表达水平及意义。 方法 健康的SD雄性大鼠65只，分为对照组（n = 12）和实验组（n = 53）。对照组不处理，于实验组中随机选取12只SD大鼠进行预实验，筛选最合适剂量的2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）造模剂构建UC动物模型。大鼠进行正式造模，通过每日观察体重及一般情况（精神状态，粪便形状、颜色等）的改变，依据疾病活动度（DAI）评分。剩余大鼠分别于第3、7、14天处死，并结合溃疡程度分为A、B、C组，每组各12只（实验过程中死亡5只）。使用结肠黏膜损伤指数（CMDI）对结肠评分，判断溃疡程度，采用ELISA法检测肠黏膜中白细胞介素-17（IL-17）、IL-35的含量指标，同时评估结肠病理改变。综合得出IL-17与IL-35的含量与溃疡程度的关系。 结果 与对照组比较，实验组DAI、CMDI分数增加，结肠组织的病理情况镜下改变显著（P < 0.05）。各组大鼠肠黏膜组织中IL-17水平随着溃疡程度加重明显升高，IL-35水平明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 在溃疡性结肠炎发展过程中，细胞因子作为炎症介质起到重要作用，IL-17含量与炎性反应呈正相关，可能促进炎性反应发生，而IL-35含量与炎症程度呈负相关，可能抑制炎性反应的发生和发展。

[关键词] 溃疡性结肠炎;SD大鼠;溃疡黏膜损伤指数;疾病活动度;白细胞介素-17;白细胞介素-35

[中图分类号] R574.62          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（c）-0015-04

[Abstract] Objective To investigate the expression level and significance of interleukin-17 （IL-17） and IL-35 in intestinal mucosa of Ulcerative colitis UC rats. Methods Six-five healthy SD male rats were divided into control group （n = 12） and experimental group （n = 53）. The blank control group was not treated， and 12 SD rats were randomly selected from the experimental group for the preliminary experiment， the most appropriate dose of TNBS （2， 4， 6-trinitrobenzenesulfonic acid） modeling agent was selected to build UC animal model. Changes in body weight and general conditions （mental status， stool shape， color， etc.） were observed daily and scored according to disease activity level （DAI） since it has been formally modeled. The rest in the control group were sacrificed on day 3， day 7 and day 14， respectively. The remaining rats were formally modeled and divided into group A ， group B and group C with 12 rats in each group according to the degree of ulcer （5 rats died accidently）. Colonic mucosa damage index （CMDI） was used to score the colon and determine the degree of ulcer. The contents of IL-17 and IL-35 in the intestinal mucosa were detected by ELISA method， and the pathological changes of the colon were evaluated at the same time. The correlation between the levels of IL-17 and IL-35 and the degree of ulcer was obtained. Results Comparison between the experimental group and the blank group， DAI score and CMDI score were increased， and the pathological changes of colon tissue in the experimental group were significant under the microscope （P < 0.05）. The level of IL-17 in the intestinal mucosa of rats in each group increased significantly with the aggravation of the ulcer， and the level of IL-35 decreased significantly， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion During the development of ulcerative colitis， cytokines play an important role as mediators of inflammation. The content of IL-17 is positively correlated with the inflammatory response and may promote the occurrence of inflammatory response， while the content of IL-35 is negatively correlated with the degree of inflammation， and may be involved in inhibiting the occurrence and development of inflammatory response.

[Key words] Ulcerative colitis;SD rats;Colonic mucosa damage;Disease activity level;IL-17;IL-35

溃疡性结肠炎（UC）以慢性非特异性炎症为主，好发于结肠，临床上多表现为腹部疼痛难忍、稀水样便甚至癌前病变，病变区域涉及黏膜表层和黏膜下层。疾病经久不愈、反复发作，这给患者带来极大的痛苦。目前关于UC发病机制的研究很广泛，但仍不能明确发病的原因。国内外学者[1]得出较为统一的观点，认为在遗传易感宿主暴露在环境危险因素下（例如细菌感染而引起肠道免疫系统紊乱），异常的免疫反应能引发大量炎症细胞释放炎性细胞因子，导致肠道组织受损和影响肠道消化功能。在肠道免疫反应应答中，细胞因子起到决定性作用。介导UC发病的细胞因子主要作用可分为促进炎性反应及抑制炎性反应两大类，例如肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）等[2]。在调控肠道免疫反应过程中，肠黏膜区促炎因子含量升高，抑炎因子含量降低，肠黏膜病损区出现明显的炎症表现：局部组织出血、溃疡，肠道损伤[3]。IL-35是由Treg细胞分泌的新型细胞因子[4]，通过抑制效应T细胞的增殖从而抑制炎性反应[5]。IL-17是Th17细胞分泌的特征性细胞因子，其能促进炎性反应的发生并协同其他炎症介质来增强炎性反应[6]。本研究通过2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）构建UC模型，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-17、IL-35在不同溃疡程度下的含量，以此来探讨其在UC发病过程中的表达及意义，在免疫学分子水平上进一步认识UC的发病本质。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD标准大鼠65只，体重为270～290 g（购自齐齐哈尔医学院实验动物中心），SPF级，动物质量合格证编号：No.430047000322111，实验动物使用许可证号：SYXK（黑）2017-0012。饲养于温度适宜、光照规律、通风良好的环境下。

1.2 主要试剂和器材

IL-35 ELISA试剂盒（批号：CD-ELA-1580）、IL-17 ELISA试剂盒（批号：CD-ELA-3479）购于武汉纯度有限公司;TNBS试剂（批号：SLBT1675）购于Sigma-Aldrich公司;石蜡包埋机（LEICAEG1150H，德国）;切片机（LEICARM2255，德国）;台式微型离心机（Thermo Electron Corporation，美国）。

1.3 方法

1.3.1 造模  造模前预先禁食48 h（正常饮水）。随机选取65只SD大鼠中12只进行预实验。另选取12只作对照组;剩余SD大鼠作为实验组进行UC造模。对大鼠进行腹腔麻醉，药品为7%水合氯醛（300 mg/kg）。标记灌胃器8 cm处作为止端刻度，并使用其将乙醇-TNBS混合溶液：TNBS液（100 mg/kg）与50%的乙醇0.25 mL从肛门灌入至结肠部位，以保证造模液精确到达预定区域。缓慢注射药液，之后缓慢旋出灌胃器。造模大鼠采用头低尾高姿态倒立10 min后放回笼中，注意保暖，覆盖卫生棉待大鼠自然清醒，仔细记录其生理变化。自由饮食。实验组3 d内出现严重腹泻、稀水脓血便的模型鼠，作为标准的UC动物模型。

1.3.2 标本制备  实验过程中有5只大鼠意外死亡。随机将剩余大鼠分为A、B、C三组，每组各12只，分别在造模后第3、7、14天将其处死。剪取肛门至盲肠末端病损严重的肠管，剥离肠系膜，便于肉眼观察及进一步病理操作。

1.3.3 观察指标  ①疾病活动度（DAI）变化：参考郑萍[7]的评分标准，根据数据记录对大鼠进行DAI评分，DAI=（体重下降分数+大便性状分数+便血情况分数）/3。见表1。②结肠黏膜损伤指数（CMDI）[8]是通过肉眼对结肠大体损伤程度的观察进行评分。大鼠肠管纹理清晰、黏膜平整、无皱缩、长度正常;肠壁薄厚均匀，未见水肿、破损及溃疡者记0分;大鼠肠管皱缩，肠壁略有充血，黏膜层次紊乱和/或肿胀，肠道内有橘黄色的黏性附着物记1分;肠管皱缩明显，黑褐色硬皮样膜状物附着于充血肿胀的肠道表面，易于撕脱，其下可见溃疡的肠黏膜并有半成型稀便附着记3分;肠管缩短、僵硬，肠壁淤血情况好转，肠道内可见积气及不成形稀便残留，黏膜表面有颗粒感，见棕色膜状物质附着于肠道表面，其下可见明显溃疡记4分。③以10%的甲醛固定病损严重的结肠段作为标本;经石蜡包埋后进行HE染色;应用病理学方法观察结肠组织[9]。④ELISA法检测UC大鼠肠黏膜组织中的IL-17、IL-35水平。比较各组大鼠DAI、CMDI评分，以及UC大鼠肠黏膜组织中IL-17、IL-35水平含量的差异。

1.4 统计学方法

使用SPSS 19.0统计软件对所測数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DAI评分

密切观察大鼠造模后生理状态，根据疾病活动度评分标准进行记录，对照组大鼠反映灵敏，表现活跃，毛色光滑，进食、排便正常。按溃疡程度分为A组、B组、C组：A组DAI评分为轻度，对刺激表现不活跃，粪便不成形;B组DAI评分为重度，不活跃，毛色暗淡，身体颤抖，粪便可见肉眼黑褐色血便;C组DAI评分为中度，精神萎靡，进食显著减轻，但腹泻较重度组有所缓解，大鼠表现有所恢复。DAI分值越高，说明UC越严重，A组至B组大鼠症状逐渐严重，C组有好转趋势。

2.2 CMDI评分

对照组大鼠肠道无缩短，肠壁黏膜平整，纹路自然，未见肿胀、糜烂及溃疡;A组大鼠的肠管发生皱缩，有不成形稀便残留，肠壁严重充血，黏膜紊乱，可见肿胀，有橘黄色的黏性物质附着于肠道内;B组大鼠肠管缩短、僵硬，但壁内淤血略有好转，颗粒状肠黏膜表面有棕色膜状物质附着，其下可见明显溃疡;C组大鼠肠管皱缩明显，黑褐色膜状物附着于严重充血的肠壁表面，其下可见明显的肠黏膜糜烂。CMDI评分为：对照组1分;A组 1.5分;B组 4分;C组 3分。随造模时间变化，CMDI评分呈现先显著升高后降低，提示A组至B组结肠损伤程度逐渐加重，C组损伤程度缓解。

2.3 病理分析

镜下可见对照组大鼠肠黏膜仅有少量淋巴细胞浸润，上皮完整，各层结构清晰明了，杯状细胞密集，无糜烂及溃疡等病损表现;A组镜下可见黏膜下层大量中性粒细胞浸润，肠黏膜的基本结构消失，杯状细胞减少，肌层变厚，隐窝结构加深，层次混乱，肠壁水肿，可见出血灶。B组镜下可见大量深达黏膜下层、肌层甚至浆膜层的以淋巴细胞及中性粒细胞为主的炎症细胞浸润;腺上皮细胞排列紊乱，部分可见轻度增生及炎性肉芽肿。C组镜下可见黏膜下肉芽组织形成，炎性细胞大量浸润及纤维组织大量增生，部分溃疡开始愈合。可以见得，A、B、C三组大鼠炎症的变化由初期逐渐加重至后期趋于缓解。

2.4 各组肠黏膜IL-17、IL-35的含量比较

经单因素方差分析，对照组、A组、B组、C组之间的IL-17、IL-35两个指标差异均有统计学意义（P < 0.05）。随大鼠病情由逐渐加重直至趋于恢复的过程中，A、B、C三组中的IL-17含量先升高后轻微下降、IL-35含量先下降随后略为升高的趋势。经LSD检验进一步两两比较，对照组与A、B、C三组差异有统计学意义（P < 0.05）。A组与B、C两组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），B、C两组差异无统计学意义（P > 0.05）。通过比较各实验组UC模型由轻到重至逐渐恢复的过程，可发现虽然C组大鼠肠黏膜中的IL-17含量高于A组（P < 0.05），但存在着先逐渐升高后轻微下降的变化趋势;而C组IL-35含量低于A组（P < 0.05），存在着先逐渐降低再略微升高的变化。

3 讨论

炎症性肠病发病以欧美国家患病率最高[10]，具有明显的地域性差异。UC的发病率为9/10万～12/10万，患病率为205/10万～240/10万[11-13]。现有研究[14-15]表明，自身免疫反应为该病的重要发病机制，IL-17和IL-35与UC的发病关系密切。

本实验通过CMDI、DAI进行疾病评分。与对照组比较实验组大鼠存在着不同程度的黏液脓血便、体重下降等症状，结肠损伤程度大小不一;通过比较实验组大鼠间的病情变化发现：第3天至第7天逐渐严重，约至第14天病情开始出现恢复迹象。

目前多数学者[16]的观点认为，IL-17主要是由Th17细胞产生。Ulhig等[17]发现在重组激活基因（RAG）缺失的情况下，IL-23仍可诱导IL-17的表达;由于RAG大鼠中缺乏T细胞和B细胞，说明IL-23可能并不是T细胞产生的，而可能是通过诱导先天免疫细胞产生IL-17，这为IL-17参与先天免疫产生提供了证据。近年来，动物模型实验的多种研究工作揭示了IL-17和IL-23在炎症性肠病中的作用[18]，IL-17可能促进了UC的慢性炎症的形成过程，IL-17表达水平与UC有密切相关性。依据本实验结果，在实验组大鼠UC由轻度逐渐加重至好转的过程中，肠黏膜的IL-17水平由A组至B组显示升高（P < 0.05），而B组至C组IL-17呈现少量减少，由于第14天可能为疾病好转初期[19]，所以IL-17水平与疾病程度对应，但差异无统计学意义（P > 0.05），IL-17同病情表现呈正相关性。本实验与郑紫丹等[20]的研究成果类似，进一步证明了IL-17能促进UC的发生和发展。

IL-35作为一种具有强大抗炎作用的新型细胞因子，具有强大的抗炎作用[21]。IL-35可以诱导T细胞分化为一种具有免疫抑制介导作用的新型调节性T细胞（iTr35）[22]，对肠道免疫应答具有重要的保护作用。依据唐文静等[23]研究，随着UC病情的加重，患者血清IL-35浓度随之减少。本研究中，在UC逐渐加重至出现好转的过程中，实验组肠黏膜的IL-35水平从A组至B组降低（P < 0.05），B组和C组少量升高。第14天可能为疾病好转初期，但IL-35升高差异尚无统计学意义（P > 0.05），IL-35水平同病情表现呈负相关，这一结论与唐文静等[23]的结果类似，从而进一步证明了IL-35的减少，可能抑制了炎症的发展。

综上所述，本实验进一步证明了随着UC病情逐渐严重，在病损区IL-35水平逐渐升高，IL-17水平逐渐降低。通过免疫学检测方法，发现UC与炎性反应密切相关;通过细胞因子的定量检测，为炎症发展提供了确凿的证据，这对判断UC病情严重程度，提供了新的检测指标，同时可以在免疫学分子水平上进一步认识UC的发病本质。这为今后进一步探索UC治愈方法提供了理论依据。

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（收稿日期：2018-08-30  本文编辑：封   华）