小鼠原代肝细胞中PTEN基因沉默所需siRNA的筛选

周龙 王立林 胡序怀

[摘要]目的 筛选出小鼠原代肝细胞中PTEN基因沉默所需的高效siRNA。方法 采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞，放入25 cm2胶原包被瓶中（1×106个/瓶），均分为5组：对照组（C组）、阴性对照组（NC组）、siR-996组、siR-1381组、siR-1519组。采用HiPerFect转染试剂将各组对应的siRNA序列转入小鼠原代肝细胞，24 h后提取RNA和蛋白，通过Real-time PCR检测各组PTEN mRNA表达，通过Western blot检测各组PTEN蛋白含量。结果 siR-996组、siR-1381组和siR-1519组的PTEN蛋白含量低于NC组，差异有统计学意义（P<0.01），siR-996组、siR-1381组和siR-1519组的PTEN mRNA水平低于NC组，差异有统计学意义（P<0.01）。siR-996组的PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平最低，其PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平的沉默效率高于siR-1381組和siR-1519组。结论 siR-996是小鼠原代肝细胞中PTEN基因沉默所需的高效siRNA。

[关键词]小鼠原代肝细胞;PTEN磷酸水解酶;小干扰RNA;胰岛素抵抗

[中图分类号] R332          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）3（b）-0022-04

胰岛素抵抗是影响危重患者预后的重要因素[1-2]，丙泊酚在临床上广泛用于处于胰岛素抵抗状态患者的镇静和麻醉，但是丙泊酚对胰岛素抵抗的影响及机制却鲜有研究。本课题组先前研究发现[3]，丙泊酚可抑制小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路，引起小鼠原代肝细胞胰岛素抵抗，但丙泊酚的作用靶点并不在GSK-3β，而是在其上游。PTEN是PI3K/Akt信号通路的重要调节基因[4-7]，处于GSK-3β上游，本课题组将选择PTEN作为研究对象，试图通过在基因水平对PTEN进行干扰，揭示丙泊酚所致胰岛素抵抗的分子机制。所以，筛选出PTEN基因沉默所需的高效siRNA是关键，吉玛基因公司以PTEN为靶基因，设计合成了3条siRNA供选择，本实验将这些siRNA转染小鼠原代肝细胞，筛选出沉默效率最高的siRNA，为后续基因沉默实验合理选择siRNA提供依据，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

siRNA-996、siRNA-1381、siRNA-1519、阴性对照siRNA（吉玛基因公司，上海），各组siRNA的序列见表1。细胞培养试剂（Invitrogen公司，美国），HiPerFect转染试剂盒（Qiagen公司，德国），SDS-PAGE试剂（Bio-Rad Laboratories公司，美国），兔抗PTEN抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，美国），M-MLV逆转录酶（Promega公司，美国），Trizol试剂盒（Invitrogen公司，美国）。雄性C57BL/6小鼠由北京大学医学部实验动物科学部提供[许可证号：SCXK（京）2016-0010]。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组  采用两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝细胞[8-9]，收集细胞于50 ml离心管中，800 r/min，8 min离心，弃上清液，用细胞培养基重新悬浮，显微镜下台盼蓝染色观察活细胞，计数，调整细胞密度，放入25 cm2胶原包被瓶中（1×106个/瓶）。这些细胞均分为5组：对照组（C组）;阴性对照组（NC组）：加入终浓度为50 nmol/L的阴性对照siRNA;siR-996组：加入终浓度为50 nmol/L的siR-996;siR-1381组：加入终浓度为50 nmol/L的siR-1381;siR-1519组：加入终浓度为50 nmol/L的siR-1519。

1.2.2 siRNA转染  按HiPerFect转染试剂盒说明书，在24孔板中每孔加入6×104个小鼠原代肝细胞，用含100 U/ml青霉素、10%胎牛血清的DMEM培养液稀释至500 μl，置于37℃的CO2培养箱中。用无血清的DMEM培养液稀释75 ng siRNA至终浓度为50 nmol/L，然后加入3 μl HiPerFect转染试剂，轻摇混匀，室温下静置10 min。将混合物逐滴加入培养皿中，混匀，置于CO2培养箱中培养24 h。

1.2.3 PETN蛋白检测  先用RIPA裂解缓冲液提取各组细胞中的总蛋白，再用BCA法检测蛋白含量。每组上样30 μg总蛋白经10%SDS-PAGE凝胶行恒压电泳，将其转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入1：1000稀释的PTEN和β-actin一抗，4℃孵育过夜，加入1：3000稀释的辣根过氧化物酶标记的相应二抗，室温孵育1 h，洗膜后采用ECL化学发光显影，最后用Gel-Pro Analyzer分析蛋白条带灰度值。

1.2.4 PTEN mRNA检测  按Trizol试剂盒的说明书提取细胞总的RNA。逆转录反应按照M-MLV逆转录酶试剂盒的说明书操作。PTEN上游引物：3′-TGTATCGCGGAGACTGACCCTTAA-5′，PTEN下游引物：5′-GATTGCAAGTTCCGCCACTGAACA-3′。HPRT1上游引物：3′-TCGTTCTGCAAGTCAGGACAGGTATTAA-5′，HPRT1下游引物：5′-TCCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTATAGC-3′。PCR的反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。PCR完毕后以HPRT1作为内参基因，采用SDS软件分析产物熔解曲线。

1.3观察指标及评价标准

比较NC组、siR-996组、siR-1381组、siR-1519组的PTEN蛋白含量及PTENmRNA水平。PTEN蛋白含量及PTENmRNA水平的沉默效率与各组的PTEN蛋白含量及PTENmRNA水平成反比，含量或水平越低，表明其沉默效率越高。

1.4统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析;以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

siR-996组、siR-1381组和siR-1519组的PTEN蛋白含量低于NC组，差异有统计学意义（P<0.01），siR-996组、siR-1381组和siR-1519组的PTEN mRNA水平低于NC组，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。siR-996组的PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平最低，其PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平的沉默效率高于siR-1381组和siR-1519组。

3讨论

胰岛素抵抗是指正常剂量的胰岛素所产生的生物学效应降低的一种现象，不仅存在于糖尿病，还可以存在于其它许多病理情况下，甚至于生理情况下[10-14]。胰岛素抵抗是导致手术患者和危重患者发生应激性高血糖的重要机制之一[1-2]。丙泊酚是当前临床上最常用的静脉麻醉剂，被广泛用于手术患者的麻醉，而且还常用于危重患者的镇静。在当前临床实践中丙泊酚常用于处在胰岛素抵抗状态的危重患者，但是丙泊酚对胰岛素抵抗的影响或机制却少有研究。先前研究表明[15]，丙泊酚可引起大鼠全身性胰岛素抵抗，但具体的分子机制尚不清楚。本课题组研究发现[3]，丙泊酚能抑制小鼠原代肝细胞Akt/GSK-3β信号通路，从而抑制糖原合成，同时还发现丙泊酚的作用靶点并不在GSK-3β，而是在GSK-3β的上游。PTEN处于GSK-3β的上游，是PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的重要调节基因[4-7]，因此在后续研究中课题组将PTEN列为观察对象，试图通过在基因水平对PTEN进行干扰，探究丙泊酚对小鼠原代肝细胞PTEN表达的影响。所以，筛选出PTEN基因沉默所需的高效siRNA是当前研究的关键。吉玛基因公司以PTEN为靶基因，设计合成了3条siRNA供选择：siR-996、siR-1381和siR-1519。本实验采用siR-996、siR-1381和siR-1519转染小鼠原代肝细胞，评价3种siRNA各自的沉默效率，旨在筛选出沉默效率最高、效果满意的的siRNA，为后续PTEN基因沉默实验选择较为理想的siRNA。

PTEN是第一个被人类发现的具有磷酸酶活性的抑癌基因[16-17]，PTEN编码的蛋白在细胞浆中表现出双重特异性磷酸酶活性，在细胞周期阻滞和细胞凋亡过程中起重要作用。PTEN蛋白募集到细胞膜上，发挥脂质磷酸酶作用，使多种蛋白质磷酸化，从而影响多条信号传导通路，最终对基因转录进行调控。PTEN被认为是PI3K/Akt信号转导的重要调节基因，PTEN结合到质膜后可催化抑制PIP3生成的反应，从而调控PI3K/Akt信号通路的转导[4-7]。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是生物体内特定基因表达受到抑制的一种现象。当细胞内导入双链RNA或短发夹RNA时，与之互补的内源性mRNA编码区将裂解，从而导致基因沉默[18]。双链RNA经外界进入细胞，被Dicer酶识别而被加工成21-25nt的双链RNA，这些短双链RNA在沉默通道中发挥主要作用，是特定mRNA被降解的主要因素，被称为小干扰RNA（siRNA）。与目标mRNA互补的siRNA可介导沉默复合体，特异性地降解与之高度互补的靶mRNA，从而抑制靶基因表达[19-20]。HiPerFect转染试剂是一种中性脂和阳离子组成的混合物，可有效摄入siRNA并释放细胞内的siRNA，基因敲除效率较高。设立对照是评估RNAi实验可信度的重要因素，本研究设立阴性对照主要是用来评估RNA干扰的特异性。本研究结果提示，siR-996组、siR-1381组和siR-1519组的PTEN蛋白含量低于NC组，差异有统计学意义（P<0.01），siR-996组、siR-1381组和siR-1519组的PTEN mRNA水平低于NC组，差异有统计學意义（P<0.01）。siR-996组的PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平最低，其PTEN蛋白含量及PTEN mRNA水平的沉默效率高于siR-1381组和siR-1519组。提示基因公司提供的3种siRNA都可不同程度地抑制PTEN表达，但以siR-996抑制程度最深、效果最满意，与NC组比较，其PTEN蛋白表达和PTEN mRNA表达均下降较多。

综上所述，本研究以PTEN为靶基因，观察比较了3种不同siRNA的沉默效率，其中siR-996的沉默效率最高，是PTEN基因沉默实验较为理想的选择。

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（收稿日期：2018-09-25  本文編辑：孟庆卿）