支气管哮喘患者外周血Th17/Treg及相关细胞因子的表达及临床意义

舒姣洁 刘思伯 刘国梁 周恒杰 葛冬

[摘要]目的 探讨支气管哮喘患者外周血辅助性T细胞17（Th17）/调节性T细胞（Treg）及相关细胞因子的表达情况及临床意义。方法 收集2016年10月～2017年10月我院收治的84例急性发作的支气管哮喘患者作为哮喘组，另选取50例健康体检者作为对照组。采用流式细胞术检测外周血Th17细胞、Treg细胞水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血白细胞介素17（IL-17）、白细胞介素10（IL-10）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达水平，并测量肺功能指标。分析患者各指标与肺功能指标的相关性。结果 哮喘组急性期的外周血Th17细胞、Th17/Treg、血浆IL-17水平高于对照组及缓解期，哮喘组缓解期以上各指标高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。哮喘组急性期的IL-10、TGF-β1、Treg细胞以及肺功能指标低于对照组及缓解期，而缓解期的IL-10、TGF-β1、Treg细胞低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;哮喘组患者急性期的外周血Th17细胞、血浆IL-17水平与肺功能指标均成负相关（P<0.05）;而Treg细胞、IL-10、TGF-β1与肺功能指标均成正相关（P<0.05）。结论 支气管哮喘患者体内存在外周血Th17/Treg平衡紊乱，其效应细胞因子分泌出现异常。外周血Th17/Treg变化可反应哮喘患者体内炎症水平，有助于对哮喘机制进行进一步研究，为临床诊疗提供新策略。

[关键词]支气管哮喘;辅助性T细胞17;调节性T细胞;细胞因子

[中图分类号] R392          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）3（b）-0018-04

支气管哮喘是最常见的慢性疾病之一，近年来发病率在我国有上升趋势，其病程较长且易反复，严重危害患者的身心健康。支气管哮喘发病机制复杂，由多种免疫因素共同参与[1]。辅助性T细胞1（T helper cell 1，Th1）/辅助性T细胞2（T helper cell 2，Th2）失衡理论在支气管哮喘气道炎症中的作用已被广泛认同，但仍不能完全解释其发病机制[2]。目前，辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）/调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）失衡作为免疫性疾病的发病机制的研究日益受到重视[3]，Th17可通过分泌白细胞介素17（interleukin 17，IL-17）发挥促炎作用[4]，Treg则可通过释放白细胞介素10（interleukin 10，IL-10）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）进而发挥免疫调节作用[5]。本研究探讨了支气管哮喘患者外周血Th17/ Treg及相关细胞因子的表达情况，旨在进一步探讨支气管哮喘的发病机制，为支气管哮喘的诊疗提供新思路及治疗靶点，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

收集2016年10月～2017年10月我院收治的84例急性发作的支气管哮喘患者作为哮喘组。纳入标准：①患者符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组修订的支气管哮喘诊断标准[6];②所有患者均处于急性发作期，即喘息、气促、咳嗽、胸闷等症状突然发生，或原有症状急剧加重，以呼气流量降低为其特征;③所有患者入组前1个月内均未使用糖皮质激素及其他免疫抑制剂、免疫调节剂等。排除标准：①合并心、肝、肾等严重躯体疾病者;②合并自身免疫性疾病及其他过敏性疾病者;③入组前1个月内，接受过糖皮质激素及其他免疫抑制剂、免疫调节剂等类药物者;④家属不同意本研究者或患者无法配合者。哮喘缓解期即经过治疗或未经过治疗临床体征正在消失，肺功能恢复到急性发作期前的水平，并维持3个月以上[6]。哮喘组中，男44例，女40例，平均年龄（39.3±3.9）岁。另选取同期于我院健康体检者50例作为对照组，其中男26例，女24例，平均年龄（40.3±2.5）岁。哮喘组和对照组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会审核及同意，纳入研究者及家属均知晓本研究情况并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集  分别采集患者急性期及缓解期以及对照组清晨空腹静脉血5 ml置于肝素抗凝管中，以2000 r/min（离心半径为11 cm）离心10 min，置于-80℃冷冻保存，上层血浆用于测量细胞因子IL-10、IL-17和TGF-β1水平，沉淀部分用于分离单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.2.2外周血Th17细胞、Treg细胞的检测  采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline）洗2次后，配制RPMI 1640培养基，加入PBMC进行细胞重悬。将悬液置于24孔板中，细胞计数2×109/L，每孔依次加入佛波酯至终浓度50 μg/L、离子霉素至750 μg/L、莫能星至2 μmol/L后，于CO2培养箱（37℃，5%CO2）中培养5 h。以2000 r/min的速度离心8 min，弃上清洗涤细胞。分别取1×106 PBMC于流式专用试管中，标记哮喘组和对照组的Th17测量管和Treg测量管，在哮喘组和对照组的Th17测量管中分别加入抗人CD4-FITC单克隆抗体，Treg测量管中加入抗人CD4-FITC和CD25-PE单克隆抗體。于室温环境下，避光孵育30 min。予PBS洗涤，350 g速度离心5 min后弃上清，重新悬浮细胞，每管各200 μl。PE标记抗人IL-17抗体，取10 μl加入两组Th17测量管中，同时两组Treg测量管中加入10 μl PE标记的抗人Foxp3抗体。Th17细胞测量管于避光、室温条件下孵育30 min，Treg测量管则于避光、4℃条件下孵育30 min。洗涤重悬，流式细胞仪进行分析。分别用CD4直方图设门区及CD4、CD25设门区分出CD4+细胞及CD4+ CD25+细胞，IL-17染色阳性为Th17细胞、FOXP3+染色阳性为Treg细胞。采用EXPO32 ADC Analysis软件进行结果分析，计算两种细胞占CD4+T细胞的比例，结果用百分数表示。相关试剂及抗体均购自美国eBioscience公司，Epics-XL流式细胞仪为美国Beckman-Coulter公司生产。

1.2.3血浆细胞因子IL-17、IL-10、TGF-β1的检测  复温血浆后测量细胞因子IL-17、IL-10、TGF-β1，采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），相关试剂盒购自美国eBioscience公司，所有步骤均严格参照使用说明书。

1.2.4肺功能的测定  BTL Industries Limited生产的BTL-08 Spiro肺功能测量仪检测肺功能指标，包括：第1秒用力呼气量（forced expiratory volume in the first second，FEV1）、第1秒用力呼量占用力肺活量比值（forced expiratory volume in one second/flow control valve，FEV1/FCV）和呼气流量峰值（peak expiratory flow，PEF）。所有项目均由肺功能室专业医师负责测量。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，采用Pearson检验进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同时期哮喘组与对照组外周血Th17细胞、Treg細胞的比较

哮喘组急性期的外周血Th17细胞、Th17/Treg高于对照组及缓解期，哮喘组缓解期的外周血Th17细胞、Th17/Treg高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。哮喘组急性期的Treg细胞低于对照组及缓解期，同时哮喘组缓解期的Treg细胞低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2不同时期哮喘组与对照组血浆IL-17、IL-10、TGF-β1的比较

哮喘组急性期的血浆IL-17高于对照组及缓解期，IL-10、TGF-β1低于对照组及缓解期，差异均有统计学意义（P<0.05）。哮喘组缓解期的血浆IL-17高于对照组，IL-10、TGF-β1低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）（表2）。

2.3不同时期哮喘组与对照组肺功能指标的比较

哮喘组急性期的肺功能指标（FEV1、FEV1/FCV、PEF）水平低于对照组及缓解期，差异均有统计学意义（P<0.05）;哮喘组缓解期的FEV1、FEV1/FCV、PEF水平与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。

2.4哮喘组患者急性期各指标相关性分析

哮喘组患者急性期的外周血Th17细胞、血浆IL-17水平与FEV1、FEV1/FCV、PEF均成负相关（P<0.05）;而Treg细胞、IL-10、TGF-β1与FEV1、FEV1/FCV、PEF均成正相关（P<0.05）（表4）。

3讨论

支气管哮喘发病机制复杂，可能受到遗传、环境、生活方式等多种因素相互作用影响[7]。气道的炎症机制被认为是其最主要的发病机制，由多种细胞（如T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞等）和细胞因子共同参与[8]。其中，T细胞具有多种生物学功能，参与大量免疫调节过程，其介导的免疫失衡在哮喘的发生发展中起到了关键作用，既往的研究已证明Th1/Th2平衡失调在支气管哮喘发病中起着重要作用[9]，但仍不能完全解释哮喘的发病机制。近年来，针对Th17细胞和Treg细胞的研究不断深入，发现Th17细胞及Treg细胞的失衡在支气管哮喘发病机制中也可能有重要作用，其相关细胞因子的表达可能参与了哮喘患者的气道炎性反应。

本研究结果提示，哮喘组急性期的外周血Th17细胞、Th17/Treg、血浆IL-17水平高于对照组，哮喘组缓解期以上各指标高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。哮喘组急性期的IL-10、TGF-β1、Treg细胞以及肺功能指标低于对照组，而缓解期的IL-10、TGF-β1、Treg细胞低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），说明与对照组相比，哮喘患者外周血Th17细胞及其效应细胞因子IL-17显着增加，而 Treg细胞及其效应细胞因子 IL-10和TGF-β1则显著下降，哮喘组的Th17/Treg细胞比值明显高于对照组，提示Th17/Treg失衡在支气管哮喘中存在重要意义，其可能通过调节各自效应细胞因子的分泌来发挥促炎及抗炎等作用。正常情况下，外周血Th17细胞和Treg细胞通常维持一个平衡状态，Th17细胞及其效应性细胞因子IL-17在机体中有促炎作用[10]，可引起气道高反应。IL-17作为促炎症因子，诱导细胞释放大量炎性因子，如IL-8、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）等，进一步大量募集中性粒细胞，最终导致气道重塑[11-12]。一方面，Treg细胞表面因子可以与靶细胞表面的受体直接结合来发挥免疫抑制作用[13]，另一方面，其还能分泌IL-10、TGF-β1等细胞因子来负反馈调节Th细胞的活化和增殖，抑制炎症反应，维持机体免疫稳态[14-15]。本研究结果提示，哮喘组急性期的外周血Th17细胞、Th17/Treg、血浆IL-17水平高于缓解期，差异均有统计学意义（P<0.05）。哮喘组急性期的IL-10、TGF-β1、Treg细胞以及肺功能指标低于缓解期，差异均有统计学意义（P<0.05），说明随着哮喘病情的缓解，肺功能水平的改善，Th17细胞、IL-17水平显著下降，而Treg细胞、IL-10、TGF-β1水平显著升高，这证明在支气管哮喘的急性发作过程中，Th17/Treg细胞亚群的失衡可能起到了重要的作用。

哮喘为气道慢性炎症反应所致的气道的可逆性阻塞及气道高反应[16]。随着发作次数的增加，有可能出现一定程度不可逆的气道损害[17]。肺功能水平能够反映哮喘患者发作时气道阻塞的严重程度以及频繁发作对气道造成的相对不可逆损害[18]。本研究进一步分析结果提示，在急性期支气管哮喘患者中，哮喘组患者急性期的外周血Th17细胞、血浆IL-17水平与肺功能指标均成负相关（P<0.05）;而Treg细胞、IL-10、TGF-β1与肺功能指标均成正相关（P<0.05）。进一步明确了外周血Th17细胞及其相关细胞因子IL-17水平的升高可能提示哮喘患者病情更为严重，气道气流受限更为明显。而Treg细胞及其相关细胞因子IL-10、TGF-β1则可能对哮喘患者气道存在保护作用。由此可知，外周血Th17细胞、Treg细胞平衡性与哮喘严重程度可能具有一定相关性。

综上所述，哮喘患者体内存在外周血Th17/Treg平衡紊乱，其效应细胞因子分泌出现异常。检测患者外周血Th17/Treg变化，可以了解哮喘患者体内炎症水平，有助于对哮喘机制进行进一步研究，为临床诊疗提供新策略。

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（收稿日期：2018-12-21  本文编辑：孟庆卿）