面膜中防腐体系对人体面颊部菌群微生态的影响研究

刘 星，代 颖，李和伟，吕景晶

皮肤的主要功能是作为天然屏障阻隔人体与外界的接触[1]。其表面栖息着大量的微生物群，分为常驻菌群与暂住菌群[2]。常驻菌群主要包括葡萄球菌属、丙酸杆菌属、微球菌属、棒状杆菌属等，而暂住菌群主要是通过接触外界获得。常驻菌群在皮肤表面形成生物膜，一方面具有占位保护效应，作为物理屏障阻挡外源性致病菌的入侵；另一方面还可通过产生抗菌肽而抑制或杀灭病原菌[3]。皮肤表面的微生物、宿主及外环境三者的相互作用形成了皮肤微生态环境[4]。影响皮肤微生态平衡的因素很多，如皮脂腺浓度、水分含量、温度，以及遗传和环境因素等[5,6]。生态平衡被打破时，可引起脂溢性皮炎、痤疮、银屑病等皮肤问题[7,8]。

目前，化妆品、面膜受到广大人群尤其是女性的青睐，为了保证化妆品的货架期和稳定性，会在配方中添加防腐剂。许多研究发现化妆品中的防腐剂是引起消费者皮肤不良反应的原因之一[9-11]，如甲醛及甲醛释放剂类的防腐剂、卡松类防腐剂（指5-氯-2甲基-4异噻唑啉-3酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮混合物，简称CIT/MIT）、硫柳汞等。蔡颖[12]的研究发现，尼泊金甲酯防腐剂能对皮肤的常驻菌群丙酸杆菌和表皮葡萄球菌产生一定的抑杀作用。相对于普通化妆品，面膜产品的防腐剂使用量约为普通化妆品的20～50倍（例：面霜每次使用量为0.5～1 g即可匀面；面膜一般每贴为25 g，甚至更多，总液体量增大20～50倍。因此假如同样添加0.5%防腐剂，由于总液体量增大了20～50倍，因此防腐剂的使用量也增大了20～50倍）。因此若防腐剂干扰面部皮肤的菌群微生态，对于消费者的皮肤微健康而言将存在很大隐患。

本文以某市售含防腐剂面膜产品为研究对象，跟踪研究了持续使用以及停用后，含防腐剂面膜产品对皮肤表面菌群的影响。同时设计出一款同配方但去掉防腐剂的面膜，并针对该未含防腐剂的面膜是否会对皮肤表面菌群产生不良影响同样进行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 受试者选择 招募健康肌肤受试者20人（男6人、女14人），年龄25～35岁，剔除各种程度的皮炎、痤疮、青春痘等受试者。对受试者进行随机分组，分为两组（受试组1和试验组2）。所有受试者均签署知情同意书。

1.1.2 面膜配方 受试组1和试验组2均选用基础配方完全相同的两种面膜：去离子水（添加比例至100%），甘油（3%），透明质酸钠（0.05%），增稠剂（0.2%），丁二醇（2%），植物提取液（5%），氨丁三醇（0.05%），其区别仅在于受试组2使用的面膜还包含了由3种防腐剂[尼泊金甲酯（0.1%），双（羟甲基）咪唑烷基脲（0.25%），碘丙炔醇丁基氨甲酸酯（0.01%）]组成的防腐体系。

1.2 方法

1.2.1 取样方法 所有受试者在首次使用面膜前于鼻翼侧至脸颊部位约10 cm2范围取样，取样时使用棉球浸泡在灭菌后的生理盐水中，擦拭皮肤取样部位后将棉球置于9 ml生理盐水中浸润，充分震荡摇匀后分别取1 ml加入到无菌培养基中。面膜的使用时间为上午9:00～10:00，单次使用时间15 min。使用后不洁面，使面膜精华液自然吸收，4 h后取样、培养。每名受试者于使用前测试初始值（0次），并开始每日使用1片面膜，无防腐剂受试组连续使用8 d面膜，防腐剂受试组连续使用4 d后停用4 d，并每日对两组受试者进行取样及菌种培养。

1.2.2 菌种培养与鉴别 各菌种种属通过细菌生化鉴定管（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）鉴定。各菌种培养条件及计数方法见表1。

表1 实验菌种培养条件

1.3 统计学方法

所有数据处理采用软件SPSS24.0进行分析。同条件两受试组初始菌群数据差异性分析采用独立样本t检验，不同条件两受试组各菌群种群动态趋势分析采用线性回归法、不同条件两受试组各菌群种群动态趋势差异性分析采用单变量多因素方差分析法。

2 结果

2.1 两组受试人群面颊部菌群初始状态相似性分析

在实验开始前，对两组受试人群面颊部进行取样、菌种培养及数据统计（表2）。根据表2对两组数据进行独立样本t检验（表3），针对菌种和人群分组以及统计数量进行双因素方差分析（表4）。由此可见，数据满足方差齐性（P=0.167＞0.05），根据齐性方差的显著性双尾检验显示两组受试人群的面颊部菌群在初始时差异无统计学意义（P=0.975＞0.05），面颊部皮肤表面的菌落、菌群数量相似。对各菌群间进行双因素方差分析，结果显示差异无统计学意义（P=0.293＞0.05），人个体的不同对菌种和菌群数量无显著影响（P=0.969＞0.05，P=0.225＞0.05）。因此，两组人群在初始状态具有相似性，受试组1使用含防腐剂面膜，试验组2使用无防腐剂面膜，进行后续实验以及数据统计，对比菌群动态差异。

表2 两组受试者面颊部各菌群初始数量统计

表3 两组受试者面颊部菌群数量差异分析

表4 两组受试者5个菌种的双因素方差分析

2.2 无防腐剂面膜测试组菌群动态

试验期间，每日对使用无防腐剂面膜组受试者进行面颊部取样、菌种培养及数据统计，种群动态变化见图1。在连续使用无防腐剂面膜8 d后，受试者面颊部表皮葡萄球菌菌落数由49.50 CFU/ml降为40.17 CFU/ml；乳酸杆菌菌落数由46.83 CFU/ml增加到70.33 CFU/ml；金黄色葡萄球菌由45.17 CFU/ml降为CFU/ml；丙酸杆菌菌落数由72.83 CFU/ml降为33.67 CFU/ml；微球菌属菌落数由27.17 CFU/ml降为15.17 CFU/ml。受试人员在8 d试验期间，面部皮肤未出现任何异常状况。

图1 连续使用无防腐剂面膜受试者面颊部菌群种群动态图

图2 连续使用含防腐剂面膜受试者面颊部各菌群种群动态图

2.3 含防腐剂面膜测试组菌群动态

试验期间，每日对使用含防腐剂面膜组受试人员进行面颊部取样、菌种培养及数据统计，种群动态见图2。

在连续使用含防腐剂面膜4 d后，受试人员的面颊部表皮葡萄球菌菌落数由55.25 CFU/ml降为0.67 CFU/ml；乳酸杆菌菌落数由92.33 CFU/ml降为1.25 CFU/ml；金黄色葡萄球菌由22.00 CFU/ml降为0.75 CFU/ml；丙酸杆菌菌落数由58.08 CFU/ml降为1.75 CFU/ml；微球菌属菌落数由16.67 CFU/ml降为0.50 CFU/ml。

停止使用含防腐剂面膜4 d后，受试人员面颊部表皮葡萄球菌菌落数增加至15.92 CFU/ml；乳酸杆菌菌落数增加至33.17 CFU/ml；金黄色葡萄球菌菌落数增加至20.83 CFU/ml；丙酸杆菌菌落数增加至30.67 CFU/ml；微球菌菌落数增加至22.08 CFU/ml。可见，停止使用含防腐剂面膜后，菌群总体呈现恢复、增长的趋势，但仍未能恢复至测试前的初始数值。

2.4 两组受试者面颊部菌群对比分析

2.4.1 两受试组人员面颊部表皮葡萄球菌种群变化趋势对比 连续使用面膜4 d后，两组受试者面颊部表皮葡萄球菌均降低，且降低趋势差异具有统计学意义（P=0.011＜0.05）（表5，图3）。

表5 两组受试者面颊部表皮葡萄球菌种群数量趋势差异性分析

2.4.2 两组受试者面颊部丙酸杆菌种群变化趋势对比连续使用面膜4 d后，两组受试者面颊部丙酸杆菌菌群数量均降低，降低趋势差异具有统计学意义（P=0.037＜0.05）（表6，图 4）。

2.4.3 两组受试者面颊部乳酸杆菌种群变化趋势对比 连续使用面膜4 d后，两组人员的面颊部乳酸杆菌菌群数量均降低，且降低趋势差异具有统计学意义（P=0.005＜0.01）（表 7，图5）。

图3 两组受试者面颊部表皮葡萄球菌种群数量趋势线性回归图

表6 两组受试者面颊部丙酸杆菌种群数量趋势差异性分析

图4 两组受试者面颊部丙酸杆菌种群数量趋势线性回归图

2.4.4 两组受试者面颊部金黄色葡萄球菌种群变化趋势对比 连续使用面膜4 d后，两组人员的面颊部金黄色葡萄球菌菌群数量均降低，且降低趋势差异具有统计学意义（P=0.026＜0.05）（表8，图6）。

2.4.5 两组受试者面颊部微球菌种群变化趋势对比连续使用面膜4 d后，两组人员的面颊部微球菌菌群数量差异无统计学意义（P=0.09＞0.05）（表9，图7）。

使用含防腐剂的面膜组，持续使用4 d后，人体面颊部菌落总数显著降低，同时金黄色葡萄球菌及丙酸杆菌占比增加；停用4 d后，菌落总数有所回升，但未达到初始水平，各菌种分布比例也未达到初始比例；使用未含防腐剂的面膜组，持续使用4 d后，人体面颊部菌落总数和菌群比例较初始值均无显著变化。比较两组种群数量动态以及各菌种比例分布，除微球菌外，均差异具有统计学意义。防腐剂对于微生态的扰动影响巨大，且恢复时间较长。

表7 两组受试者面颊部乳酸杆菌种群数量趋势差异性分析

图5 两组受试者面颊部乳酸杆菌种群数量趋势线性回归图

表8 两组受试者面颊部金黄色葡萄球菌种群数量趋势差异性分析

图6 两组受试者面颊部金黄色葡萄球菌种群数量趋势线性回归图

表9 两组受试者面颊部微球菌种群数量趋势差异性分析

图7 两组受试者面颊部微球菌种群数量趋势线性回归图

3 讨论

近年来随着对表皮微生物的深入认识，人们越来越多的开始从生态学的角度来探讨皮肤微生态中不同菌群与人体的相互关系。有研究发现特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）的发病机制中，微生物屏障的破坏实际就是皮肤菌群的失调。发病期间，皮肤菌群多样性显著下降，金黄色葡萄球菌数量显著上升，并与疾病的严重程度密切相关，且抗菌肽与防御素含量显著下降[13-15]。Fitz等[16]提取了49例痤疮患者和50名健康人鼻部皮脂腺中痤疮丙酸杆菌的16S rDNA序列，发现RT4和RT5型痤疮丙酸杆菌与痤疮患者密切相关。

目前化妆品中使用频率较高的防腐剂有苯甲酸及其酯类、溴硝丙二醇、碘代丙炔基氨基甲酸丁酯、1，3-二甲羟甲基二甲基乙内酰脲等，但对于这些常见防腐剂有研究表明其对人体具有一定的负面影响。如1，3-二甲羟甲基二甲基乙内酰脲释放出游离的甲醛，长期大量接触具有致癌效果，许多行业已经限量或禁止使用[17]；欧盟的新法规中，禁用异丁酯，甲酯丙酯限量由0.8 降到0.19；丹麦禁止在3岁以下儿童产品中加入尼泊金酯类防腐剂等[18]。根据《化妆品安全技术规范》（2015版），我国对于化妆品中准用的防腐剂种类已从56种减少为51种，并对用量与使用范围作出了更为严格的规定，体现出减少防腐剂在化妆品中使用的趋势。

本研究同样发现，持续使用含防腐剂的面膜产品可使面颊部菌群多样性发生显著变化，使得皮肤常驻菌群表皮葡萄球菌、以及有益菌乳酸杆菌的占比显著降低，而金黄色葡萄球菌的占比显著增加。使用无防腐剂的面膜产品则对面颊部菌群微生态无显著影响。表明防腐剂的添加是导致面颊部菌群微生态扰动的因素之一。

近年来，化妆品行业中出现了益生元生物制品类，主要是利用益生菌在发酵中产生的代谢物质调整皮肤菌群微生态起到护肤效果。市售产品如：SK-Ⅱ“神仙水”中的“Pitera”成分是一种复膜孢酵母代谢产物；雅诗兰黛“小棕瓶”眼霜中主打的“Bi fi da”成分也是一种二裂酵母发酵物质；超声破碎乳酸菌得到的中性鞘磷脂酶可以治疗特应性皮炎、银屑病、鱼鳞病等皮肤疾病[19]。这些物质可起到提高表面皮肤益生菌菌群活性、抑制有害菌群的生长作用，进而达到调节皮肤生理活动、延缓皮肤细胞衰老的效果[20]。

因此，对于面膜类的产品，安全性与功效性同等重要，减少、甚至不再添加防腐剂，推荐人们使用减少、甚至不含防腐剂的面膜产品，同时从微生态调节的角度对添加成分进行优化，将对产品安全性和功效性的提高具有广泛的应用价值。