核桃油中亚油酸分离纯化技术研究及其降血脂功能评价

戚登斐，张润光，韩海涛，杨 涛，张有林

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710119)

核桃仁中油脂含量高达60%～70%。核桃油中亚油酸、亚麻酸及油酸等不饱和脂肪酸含量高达90%，具有很高的营养及药用价值[1-3]。亚油酸作为一种不饱和脂肪酸，是人体不能合成或合成量远不能满足需要的必需脂肪酸，其参考摄入量最低占摄入总能量的2.5%。亚油酸能有效降低人体血液胆固醇含量[4]，提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量[5]，阻碍脂质在血管壁上累加沉积，预防动脉粥样硬化，使得血管壁功能得到完善和提高[6-8]。

与超临界萃取法[9]、色谱分离法[10]、分子蒸馏法[11]、精馏分离法[12-13]等分离纯化不饱和脂肪酸的方法相比，尿素包合法具有设备简单、节约成本、工艺流程简化、高温下能停止反应等优点，且形成尿素包合物后，不饱和脂肪酸双键由于包合物的保护而不易发生氧化，使其生理活性良好且适合大规模分离、富集各种不饱和脂肪酸[14]。本文通过单因素试验初步优化了尿素包合法提取分离亚油酸的工艺，同时以昆明小鼠为研究对象，探讨核桃油中亚油酸降血脂功能，以期为研制降血脂功能性食品和核桃油不饱和脂肪酸功能评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

核桃：香玲品种，西安市核桃良种资源圃提供，经冷榨，制备核桃油；花生油：鲁花5S压榨一级油(非转基因)，市场购买；亚油酸：本实验室自制，纯度99.5%；昆明小鼠：雄性，体重(22.0 g±2.0 g)，西安市第四军医大学试验动物中心提供；基础饲料：西安市第四军医大学试验动物中心提供(亚油酸含量≤0.5%)；高脂饲料：用85%基础饲料、2%胆固醇、12.5%猪油、0.5%胆酸钠配制而成；尿素、乙醇、无水硫酸钠、石油醚、丙酮、硫酸、甲醇、盐酸、氢氧化钾：分析纯；异辛烷：色谱纯；混合脂肪酸甲酯标准品(纯度>99.6%)：购于美国Sigma公司；甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)等测定试剂盒：购于上海荣盛生物技术有限公司。

PHS-3C 精密pH计，TDL80-2B离心沉淀机，TRACE 2000型气相色谱仪(美国热电公司)，JB-3定时恒温磁力搅拌器，RE-52旋转式蒸发器。

1.2 试验方法

1.2.1 核桃油中脂肪酸混合液的制备

参考Gu等[15]的方法。称取50 g核桃油并与200 mL 4%的KOH-95%乙醇溶液混合置于烧瓶中，升温至75℃，皂化回流2 h，加入温水，搅拌30 min使皂化物充分溶解。调节pH至2，恒温搅拌15 min，在分液漏斗中分离出油层，加适量石油醚溶解，温水洗涤至中性。加入一定量无水Na2SO4脱水，过滤，于40℃下旋转蒸发，除去有机溶剂，制得核桃油中脂肪酸混合液并称重。

1.2.2 尿素包合法

参考Gu等[15]的方法。将95%乙醇与尿素按比例加入烧瓶中，升温至65℃搅拌，待尿素全部溶解，向其中加入制备好的脂肪酸混合液，水浴回流40 min，冷却至室温后迅速转入低温。一段时间后取出迅速减压抽滤得到滤液和尿素结晶物，旋转蒸发除去滤液中乙醇，将滤液剩余物溶解于40℃温水中并调节pH至2，转移至分液漏斗中，加入适量石油醚，后水洗至中性，加入无水Na2SO4干燥，旋转蒸发，即可得到尿素包合后的多不饱和脂肪酸，称重，按下式计算脂肪酸得率。

脂肪酸得率=纯化后脂肪酸的质量/纯化前混合脂肪酸的质量×100%

1.2.3 亚油酸纯度测定

甲酯化：在烧瓶中称取0.1 g脂肪酸样品，70℃水浴锅中甲酯化30 min，同时加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液。后加入2 mL异辛烷，加入蒸馏水至瓶颈口，静置分层，选取异辛烷层进行气相色谱分析。

气相色谱条件：HP-INNOWAX石英毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；采取程序升温模式，起始温度140℃并保持5 min，后以4℃/min 升温至 220℃，保持15 min；进样口温度260℃，检测器温度280℃；氮气为载气，流速1.0 mL/min；分流比20∶1，进样量1 μL；FID检测器。

采用面积归一化法计算亚油酸的纯度。

1.2.4 亚油酸降血脂试验

1.2.4.1 试验设计

选取健康雄性昆明小鼠110只，基础饲料适应性喂养3 d，随机分为11个小组(见表1)，空白对照组G1饲喂基础饲料，其他各组均饲以高脂饲料，其中G2组小鼠灌胃高脂饲料，为高脂模型组，G3～G11组每天上午9点分别按表1灌胃不同剂量的核桃油、花生油及亚油酸。各组小鼠自由饮水，自然光照，饲喂4周。

表1 试验动物剂量设计及分组

注:表中选用剂量参考小鼠最适宜油脂摄入量。

1.2.4.2 小鼠血脂测定及动脉硬化指数计算

4周后，小鼠均禁食12 h后摘除眼球，眼眶采血， 3 000 r/min离心5 min，分离得到血清，用试剂盒法当天测定TG、TC、HDL-C、LDL-C含量，按下式计算动脉硬化指数(AI)。

1.2.4.3 小鼠肝脏系数的测定

小鼠按上述方法取血后，随即引颈处死，立即取出肝脏，用生理盐水洗净，滤纸吸去多余水分，称重，按下式计算肝脏系数。

肝脏系数=肝脏质量/体重×100%

1.2.5 数据处理

采用Excel软件对试验数据进行处理，结果均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 尿素包合法分离纯化亚油酸条件优化

2.1.1 最佳包合时间确定

在尿素包合温度-10℃、95%乙醇与尿素体积质量比值4、混合脂肪酸与尿素质量比值0.4条件下，测定包合时间分别为6、12、18、24、30、36 h时亚油酸纯度及产品得率，结果见图1。

图1 包合时间对亚油酸纯度及产品得率的影响

由图1看出，包合时间在6～24 h内，亚油酸纯度和产品得率随包合时间延长而升高。包合24 h结晶过程大体完成，亚油酸纯度最佳；之后亚油酸纯度，产品得率变化不大。因此，以包合时间24 h为佳。

2.1.2 最佳包合温度确定

在包合时间24 h、95%乙醇与尿素体积质量比值4、混合脂肪酸与尿素质量比值0.4条件下，测定包合温度在-15、-10、-5、0、5、10℃时亚油酸纯度及产品得率，结果见图2。

图2 包合温度对亚油酸纯度及产品得率的影响

由图2看出，亚油酸纯度随包合温度升高而降低，但产品得率提高。原因可能是体系温度提高后因亚油酸氧化而对包合纯度有影响。此外，在形成尿素包合物时体系放热，反应随温度降低朝正向进行，进而快速形成包合物晶体便于分离，但当温度低于一定范围，虽然滤液中的亚油酸纯度提高，但一定程度影响了产品得率。因此，综合考虑，较为理想的包合温度为-5℃。

2.1.3 混合脂肪酸与尿素最佳质量比值确定

在包合温度-5℃、95%乙醇与尿素体积质量比值4、包合时间24 h条件下，测定混合脂肪酸与尿素质量比值分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7时亚油酸纯度及产品得率，结果见图3。

图3 混合脂肪酸与尿素质量比值对亚油酸纯度和产品得率的影响

由图3看出，亚油酸纯度随混合脂肪酸与尿素质量比值的增加而降低，在混合脂肪酸与尿素质量比值小于0.3时，产品得率随混合脂肪酸与尿素质量比值的增加而提高，之后产品得率基本恒定。原因可能是脂肪酸混合液中的单不饱和脂肪酸能在分子结晶时与尿素结合并析出稳定的晶体包合物，而混合液中的多不饱和脂肪酸由于其结构难以被尿素包合。反应时尿素量较少会降低包合程度，使包合不充分，随着体系中尿素含量的增加，包合越充分，使产品得率降低。综合考虑，以混合脂肪酸与尿素质量比值0.3为佳。

2.1.4 95%乙醇与尿素最佳体积质量比值确定

在包合温度-5℃、混合脂肪酸与尿素质量比值0.3、包合时间24 h条件下，测定95%乙醇与尿素体积质量比值分别为2、3、4、5、6、7时亚油酸纯度及产品得率，结果见图4。

由图4可知，亚油酸的纯度和产品得率均随95%乙醇与尿素体积质量比值增加而缓慢提高。其原因可能是伴随溶剂量加大，脂肪酸溶解度也在逐渐增大，从而产品得率得以提高，也增强了尿素对核桃油中饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸的结合能力，亚油酸纯度得以提高。综合可知，尿素包合时95%乙醇与尿素体积质量比值为5时最佳。

图4 95%乙醇与尿素体积质量比值对亚油酸纯度和产品得率的影响

2.2 尿素包合亚油酸纯度及脂肪酸的组成

由单因素试验确定尿素包合法分离纯化亚油酸最佳工艺条件为：包合温度-5℃，包合时间24 h，95%乙醇与尿素体积质量比值5，混合脂肪酸与尿素质量比值0.3。在最佳工艺条件下进行3次平行验证试验，得到亚油酸的气相色谱图见图5，亚油酸的平均纯度为80.21%，说明优化得到的提取条件可靠。

图5 核桃油尿素包合纯化后脂肪酸气相色谱图

2.3 核桃油中亚油酸功能评价

2.3.1 对小鼠体重的影响(见图6)

图6 不同剂量花生油、核桃油、亚油酸对小鼠体重影响

由图6看出，随饲喂时间的延长，空白对照组与高脂模型组小鼠体重的变化趋势基本相同。在给小鼠连续灌胃28 d不同剂量的花生油、核桃油、亚油酸之后，小鼠体重虽高于空白对照组，但低于高脂模型组。花生油组与核桃油组小鼠的体重均随剂量的增加而增加。在亚油酸组中，随剂量增加，小鼠体重呈直线下降趋势。由此可见，亚油酸对于降低高脂小鼠体重作用明显。

2.3.2 对小鼠肝脏的影响(见图7)

图7 不同剂量花生油、核桃油、亚油酸对小鼠肝重与肝脏系数的影响

由图7看出，在给小鼠连续灌胃28 d不同剂量花生油、核桃油、亚油酸之后，小鼠肝重和肝脏系数虽然高于空白对照组，但低于高脂模型组。花生油组与核桃油组小鼠的肝重和肝脏系数均随灌胃剂量的增加而增加。亚油酸组中，随灌胃剂量增加，小鼠的肝重和肝脏系数呈直线下降趋势。由此可知，亚油酸能明显降低高脂小鼠肝重与肝脏系数。

2.3.3 对小鼠血脂的影响

2.3.3.1 对血清中TG及TC水平的影响(见图8)

图8 不同剂量花生油、核桃油、亚油酸对小鼠TC与TG水平的影响

由图8看出，高脂模型组相比于空白对照组，小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平均有明显升高，表示小鼠高脂血症模型构建成功。给建模后小鼠连续灌胃28 d不同剂量的花生油、核桃油、亚油酸，小鼠血清TC、TG水平明显低于高脂模型组。花生油组与核桃油组小鼠血清TC、TG水平均随灌胃剂量的增加而下降。亚油酸组小鼠血清TC、TG水平随灌胃剂量的增加呈下降趋势。由此可知，亚油酸降低高脂小鼠血清TC、TG水平能力更优。

2.3.3.2 对血清HDL-C和LDL-C水平的影响(见图9)

由图9看出，小鼠灌胃28 d，与空白对照组相比，高脂模型组小鼠HDL-C、LDL-C水平发生了明显的变化，建模成功。给小鼠连续灌胃28 d不同剂量的花生油、核桃油、亚油酸之后，小鼠血清HDL-C 水平明显高于高脂模型组， LDL-C水平明显低于高脂模型组。花生油组与核桃油组小鼠血清HDL-C水平随灌胃剂量的增加而明显升高， LDL-C随灌胃剂量的增加而明显降低。亚油酸组中，随灌胃剂量的增加，HDL-C呈直线上升趋势， LDL-C呈直线下降趋势。

图9 不同剂量花生油、核桃油、亚油酸对HDL-C与LDL-C水平影响

2.3.3.3 对动脉硬化指数的影响(见图10)

图10 不同剂量花生油、核桃油、亚油酸对AI的影响

由图10看出，小鼠灌胃28 d，高脂模型组小鼠的动脉硬化指数(AI)明显高于空白对照组，说明高脂模型组小鼠患高脂血症概率增加。与高脂模型组相比，在给小鼠连续灌胃28 d不同剂量的花生油、核桃油、亚油酸之后，小鼠的AI明显下降，说明花生油、核桃油、亚油酸均有降低小鼠患高脂血症的作用。花生油组与核桃油组小鼠的AI随灌胃剂量的增加而下降。亚油酸组中，随灌胃剂量的增加小鼠的AI明显下降。由此可知，亚油酸降低高脂小鼠的AI作用更优。

3 结 论

本试验以冷榨核桃油为原料，通过单因素试验初步确定尿素包合法分离纯化亚油酸的最佳工艺条件为：包合时间24 h，包合温度-5℃，95%乙醇与尿素体积质量比值5，混合脂肪酸与尿素质量比值0.3。后对小鼠连续灌胃28 d不同剂量的花生油、核桃油及核桃油分离的亚油酸，研究其对小鼠体重、肝重、肝脏系数、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和动脉硬化指数(AI)的影响。结果表明，与高脂模型组小鼠相比，核桃油分离的亚油酸显著降低高脂小鼠体重、肝重及肝脏系数，降低高脂小鼠血清TC、TG水平，具有提高血液HDL-C 水平、降低LDL-C水平及AI的能力。