栀子油对ConA诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的保护作用

朱梓豪，罗光明，张风波，张俊逸，柴华文，刘培培，王得运，艾永强

(江西中医药大学 药学院，南昌 330004)

研究表明，肝脏疾病是对人类健康造成损害的重要疾病之一，而肝内免疫反应是引起肝细胞损伤的重要原因[1]，其中T淋巴细胞介导的异常免疫应答是引起肝细胞损伤及破坏的直接因素[2]。因此，多种免疫效应细胞及细胞因子参与的免疫反应在肝损伤的发生及发展过程中起到关键作用。

栀子为市面上常见大宗药材之一，来源于茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实[3]，性苦、味寒，具有泻火除烦、凉血解毒的功效，主要含有环烯醚萜类、有机酸类和栀子黄色素等成分[4]。目前国内外对栀子现代药理研究及药物开发主要是针对环烯醚萜类成分，少有对栀子油进行药理研究。本课题组前期建立四氯化碳致肝损伤模型，得到栀子油对四氯化碳所致急性肝损伤具有保护作用[5-6]，现采用刀豆蛋白A(ConA)建立免疫性肝损伤模型，探讨栀子油对ConA诱导的免疫性肝损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级KM雄性小鼠，体重16～20 g，共72只，由山东省实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(鲁)20140007。于江西中医药大学实验大楼动物房饲养，自由进食进水，适应3 d，动物房温度25～28℃，湿度35%～55%。

1.1.2 药品与试剂

栀子，购于江西省九江市湖口县顺昌栀子药材基地，经江西中医药大学中药资源学科罗光明教授鉴定为茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实；丙氨酸氨基转移酶(ALT，批号:20170611)、天门冬氨酸转移酶(AST，批号:20170607)、乳酸脱氢酶(LDH，批号：20170614)、一氧化氮(NO，批号：20170528)、超氧化物歧化酶(SOD，批号:20170615)和丙二醛(MDA，批号:20170610)试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。苏木素-伊红染液(批号：20170428)，购于南京建成生物工程研究所，联苯双酯滴丸(生产批号: 160605，每丸1.5 mg，购于浙江万邦药业股份有限公司)。

动物组织总RNA 提取试剂盒，天根生物科技(北京)有限公司，生产批号：P4805；反转录试剂盒，普洛麦格生物技术有限公司(USA)，生产批号：ADA5000 00002284267；内参GAPDH、TNF-α、IFN-γ、CXCL-10引物，合成于捷瑞生物科技工程有限公司(上海)。引物具体序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.1.3 仪器与设备

DY89- II电动匀浆机；UV-1800型紫外可见光分光光度计，岛津公司(日本)；MULTISKAN GO酶标仪，赛默飞世尔科技公司(上海)；Allegra64R 高速冷冻离心机，美国Beckman公司；凝胶成像仪，美国BIO-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 栀子油的提取

取干燥后的栀子药材，粉碎后，过20目筛，加5倍量的石油醚，85℃索氏提取3 h，提取结束后旋蒸回收石油醚，得栀子油，称重并计算其得率，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 实验分组及给药

取60只昆明小鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白组、免疫性肝损伤模型组、联苯双酯阳性组(200 mg/kg)，栀子油低剂量组(0.3 g/kg)、栀子油中剂量组(0.6 g/kg)、栀子油高剂量组(1.2 g/kg)，栀子油剂量在得率及药典栀子生药推荐摄入量的基础上得到，栀子油剂量组用0.5%吐温-80溶液进行溶解。小鼠适应性饲养3 d后开始给药，空白组和免疫性肝损伤模型组小鼠经口灌胃0.5%吐温-80溶液，其他各组小鼠灌胃相应的药物，每天1次，连续给药10 d 。

1.2.3 免疫性肝损伤改良模型建立[7-8]

采用改良后的造模方法，连续给药10 d，末次给药1 h后，除空白组小鼠给予相同剂量的注射生理盐水外，其余各组小鼠一次性尾静脉注射ConA 15 mg/kg，禁食不禁水8 h，然后处理小鼠，取材检测。

1.2.4 血清ALT、AST、LDH水平测定

造模后8 h，小鼠进行摘眼球取血，4℃、全血3 000 r/min离心10 min，分离血清，按照试剂盒说明书检测血清中ALT、AST、LDH水平。

1.2.5 小鼠肝脏SOD、MDA、NO水平测定

小鼠取血后处死，取0.1 g肝脏组织，加4℃生理盐水制成 10%的肝匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液，检测SOD、MDA、NO水平。

1.2.6 肝脏病理学观察

取小鼠相同部位的肝组织，用10%甲醛溶液固定，之后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片展片、HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理学变化。

1.2.7 RT- PCR检测肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、CXCL-10 mRNA的表达水平

取小鼠相同部位肝组织，用动物组织总RNA提取试剂盒提取总RNA，逆转录合成cDNA，以GAPDH作为参照基因进行扩增，检测肝组织中TNF-α、IFN-γ、CXCL-10 mRNA的表达水平，实验操作步骤均按试剂盒说明书进行。

1.2.8 数据分析

2 结果与讨论

2.1 栀子油对ConA致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST、LDH水平的影响(见表2)

表2 栀子油对小鼠血清 ALT、AST 和LDH水平的影响 U/L

注：与空白组比较，△p<0.05，△△p<0.01，△△△p<0.001；与模型组相比，*p<0.05，* *p<0.01，* * *p<0.001。下同。

由表2可知，与空白组相比，模型组小鼠血清 ALT、AST及LDH水平极显著升高(p<0.001)，具有显著性差异，符合统计学意义，表明免疫性肝损伤模型建造成功。与模型组相比，联苯双酯组小鼠血清中ALT、AST和LDH水平均极显著下降(p<0.001)，具有统计学意义；栀子油中、高剂量组小鼠血清中ALT、AST和LDH水平均具有显著或极显著性降低趋势(p<0.05，p<0.001)，且高剂量组优于中剂量组，呈剂量依赖性。表明栀子油对ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤具有一定的保护作用。

2.2 栀子油对Con A致急性肝损伤小鼠肝脏组织NO、SOD和MDA的影响(见表3)

表3 栀子油对小鼠肝脏组织NO、SOD和MDA水平的影响

由表3可知，与空白组比较，模型组小鼠肝组织产生了明显的氧化应激反应，表现在NO和MDA水平极显著提高(p<0.001)，SOD活力极显著降低(p<0.001)，具有统计学意义。与模型组相比，栀子油低、中、高剂量组NO和MDA 水平显著或极显著降低(p<0.05,p<0.01,p<0.001)，SOD水平显著或极显著地升高(p<0.05,p<0.001)，且具有统计学意义，改善程度高剂量组优于中低剂量组，呈剂量依赖性。

2.3 栀子油对ConA致急性肝损伤小鼠肝脏组织TNF-α 、CXCL-10、IFN-γ mRNA 表达的影响(见图1)

由图1可知，与空白组相比，急性免疫性肝损伤模型组小鼠肝脏组织 TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相对表达量发生极显著性增高，差异有统计学意义(p<0.001)。与模型组比较，联苯双酯组小鼠肝组织中TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相对表达量极显著降低，差异具有统计学意义(p<0.001)；栀子油低、中、高剂量组均显著或极显著地降低了小鼠肝组织中 TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相对表达量，差异均具有统计学意义(p<0.05，p<0.01,p<0.001)。

2.4 肝脏病理学检查(见图2)

由图2可知，光镜下观察空白组小鼠肝组织结构清晰，肝小叶结构正常，肝细胞呈放射状围绕中央静脉，排列整齐，汇管区无异常，未发生细胞坏死及炎性浸润现象。模型组小鼠肝组织出现明显的肝小叶紊乱，细胞肿胀及浸润，排列无规律，肝组织严重损伤；联苯双酯组小鼠肝组织细胞变性、肿胀及坏死情况较模型组均不同程度改善，但仍有少量炎性细胞浸润；与模型组比较，栀子油各剂量组小鼠肝组织损伤情况呈不同程度改善，肝小叶紊乱情况改良，细胞水肿及坏死情况均有不同程度减轻，细胞炎性浸润状况也减弱，且高剂量组改善情况明显优于中、低剂量组，说明栀子油对肝损伤具有保护作用且呈剂量依赖性。

2.5 讨论

刀豆蛋白A为一种糖类结合蛋白质，是一种植物血凝素，具有强力的促进有丝分裂作用，能较好地促淋巴细胞转化反应，其诱导的小鼠肝损伤模型与人体急慢病毒、自身免疫性缺陷导致的肝病相似[9]，是探讨免疫性肝病机制及筛选抗肝损伤药物的理想模型之一。

3 结 论

本实验设定栀子油3个给药剂量，与模型组相比，栀子油各剂量组均能降低血清ALT、AST和LDH含量，提高肝脏SOD活性，降低肝组织NO、MDA的产生，RT-PCR检测结果显示肝组织中TNF-α、CXCL-10、IFN-γ mRNA的相对表达量降低，肝脏病理学观察表明肝组织变性及坏死等病理症状明显改善，且呈现一定的剂量依赖趋势，其保肝的机制可能与提高肝组织抗氧化酶体系活力，抑制氧化应激反应及炎性因子表达有关。