寄生壮骨颗粒对木瓜蛋白酶诱导大鼠骨关节炎的作用研究

洪 铁 *，何丽明 ，刘 放 ，郭 敏

(1.吉林省中医药科学院，长春130012；2.吉林大学药学院药理教研室，长春130021；3.吉林农业大学中药材学院，长春130118）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是人类中最常见的关节炎形式，一种关节整体的退行性疾病。其特征主要在于对关节软骨、软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉的影响。因其病因及作用机制不清楚，早期诊断和治疗均存在问题，需要进一步深入研究[1]。寄生壮骨颗粒是吉林省中医药科学院骨科专家以传统中医药理论为指导，在长期临床实践中总结出的经验方。全方由桑寄生、威灵仙、独活、秦艽、白芷、防风、赤芍、延胡索等多味中药组成。寄生壮骨颗粒在多年临床治疗骨关节炎疾病方面取得了较好的疗效。本研究探讨了寄生壮骨颗粒对木瓜蛋白酶诱导大鼠骨关节炎的影响，以期为寄生壮骨颗粒治疗骨关节炎提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠，雄性，50只，体质量210～250 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，将动物于动物室适应性饲养一周，温度为20～25℃，湿度为60%～70%，12h明暗交替照明，给予维持饲料，自由饮水。

1.2 实验试剂

木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸由北京索莱宝科技有限公司生产；盐酸氨基葡萄糖胶囊由北京康必得药业有限公司生产；大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒、大鼠白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供；大鼠基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）ELISA试剂盒由武汉默沙克生物科技有限公司提供；糖胺聚糖试剂盒由上海通蔚科技有限公司生产。

1.3 实验仪器

全波长酶标仪，Biotek公司；手持式高速匀浆机，上海巴玖实业有限公司；BS124S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；3-18k低温高速冷冻离心机，Sigma公司；XPX-9052 MBE数显不锈钢电热培养箱，上海博迅实业有限公司。

2 方法

2.1 分组给药与动物模型的建立

将50只Wistar雄性大鼠，随机分成6组，模型组10只，其它各组每组8只，分笼饲养。分别为正常对照组，模型组（10%木瓜蛋白酶+0.03mol/L L-半胱氨酸），盐酸氨基葡萄糖阳性药对照组0.13g/kg，寄生壮骨颗粒高剂量组8.69g/kg生药、中剂量组4.35g/kg生药、低剂量组2.12g/kg生药。

将10%木瓜蛋白酶与0.03 mol/L的L-半胱氨酸按1∶1混合静置30 min后备用。在实验第0、3、6天，模型组，阳性药对照组，寄生壮骨颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组给药组大鼠膝关节腔注入0.2 mL混合溶液诱导骨关节炎模型[2]。正常对照组注射等体积生理盐水。在末次注射木瓜蛋白酶混合溶液后，分别给予给药组灌胃阳性药及三个浓度的受试药物，模型组、正常对照组灌服等体积的生理盐水，每天一次，共计4周。

2.2 观测指标

2.2.1 大鼠一般情况

观察各组大鼠精神状态、毛发、进食量及活跃状态程度。

2.2.2 大鼠体重变化及双膝关节宽度

观察并记录大鼠实验周期的体重变化。测量造模前、给药前，以及给药第 1、2、3、4周的踝关节宽度，取3次测量的平均值，按照以下公式计算出关节肿胀度。

关节肿胀度(mm)=致炎后（给药后）踝关节宽度-致炎前踝关节宽度

2.2.3 血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量测定

大鼠麻醉后腹主动脉取血，血液至少静置45min，4℃，3500r/min， 离心 15min， 分离血清分装-80℃冻存。采用ELISA试剂盒测量血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

2.2.4 血清中MMP-3、MMP-13的含量测定

采用ELISA试剂盒测量血清MMP-3、MMP-13的水平。

2.2.5 滑膜组织中糖胺多糖含量测定

取称量好的滑膜组织，加入冰生理盐水，置于冰浴中用组织匀浆器制成2%滑膜组织匀浆，在4℃下，3500 r/min，离心10 min。取上清液，采用二甲基亚甲蓝分光光度法测定糖胺多糖的含量。

2.3 统计学处理

全部实验数据均采用SPSS17.0软件进行，根据检验数据资料的正态性和方差齐性，各组数据均用±s表示，组间比较采用t检验比较差异的显著性。

3 结果

3.1 大鼠一般情况

实验开始前，各组实验大鼠膝关节活动度正常，局部无肿胀，皮毛光滑，灵敏度佳，精神状态及饮食、饮水能为正常。

造模过程中未出现大鼠死亡。造模结束后的大鼠除正常对照组行动正常，其余各组表现精神不振，膝关节稍有跛行。治疗4周后正常对照组大鼠膝关节活动正常，饮食、饮水正常，毛色光亮，反应灵敏；模型组的大鼠均出现膝关节局部肿胀，少动，饮食、饮水减少，反应迟纯等。其它给药组大鼠膝关节肿胀度，活动情况，饮食、饮水量，反应敏捷性均有不同程度的减轻。

3.2 大鼠体重变化、双膝关节宽度的结果

各组大鼠造模后第1周内体重增长缓慢，第2周体重开始恢复，第3周至第4周实验结束体重开始逐渐增长。所有造模动物在实验初期起始体重与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，实验第2周开始，与正常对照组相比，模型组体重显著降低 (P＜0.05)，与模型组相比，各给药组大鼠体重明显升高，结果见表1。

实验结果表明,正常对照组实验前后膝关节直径无变化。与正常对照组相比，模型组大鼠膝关节直径显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，阳性药对照组、寄生壮骨颗粒高剂量组的膝关节直径显著降低 （P＜0.01），寄生壮骨颗粒中、低剂量组的膝关节直径明显降低（P＜0.05），结果见表 2。

表1 寄生壮骨颗粒对大鼠体重的结果 （±s）

表1 寄生壮骨颗粒对大鼠体重的结果 （±s）

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 寄生壮骨颗粒对大鼠膝关节肿胀度的结果（±s）

表2 寄生壮骨颗粒对大鼠膝关节肿胀度的结果（±s）

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.3 血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 的结果

与正常对照组相比，模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量显著升高（P﹠0.01）；与模型组相比，阳性药对照组、寄生壮骨颗粒高剂量组的IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著降低（P﹠0.01），寄生壮骨颗粒中、低剂量组的 IL-6、IL-1β、TNF-α 含量明显降低 （P﹠0.05）。结果见表3。

表3 寄生壮骨颗粒对大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量结果

3.4 血清中MMP-3、MMP-13的结果

与正常对照组相比，模型组大鼠血清中MMP-3、MMP-13含量显著升高（P﹠0.01）；与模型组相比，阳性药对照组、寄生壮骨颗粒高剂量组的MMP-3、MMP-13含量显著降低（P﹠0.01），寄生壮骨颗粒中、低剂量组的 MMP-3、MMP-13含量明显降低 （P﹠0.05），结果见表 4。

表4 寄生壮骨颗粒对大鼠血清中MMP-3、MMP-13含量结果

3.5 滑膜组织中糖胺多糖含量测定

与正常对照组相比，模型组大鼠滑膜组织糖胺多糖含量显著降低（P﹠0.01）；与模型组相比，阳性药对照组、寄生壮骨颗粒高剂量组的糖胺多糖含量显著升高（P﹠0.01），寄生壮骨颗粒中、低剂量组的糖胺多糖含量明显升高（P﹠0.05），结果见表5。

表5 寄生壮骨颗粒对大鼠滑膜组织糖胺多糖的结果

4 讨论

骨性关节炎好发于膝关节、脊柱及手指关节等部位，是以关节软骨退变和骨质增生为基本特征的慢性进行性骨关节疾病。随着全球老龄化的加剧，骨性关节炎已成为加重经济负担、影响人们生活质量的社会性问题[3]。

TNF-α在骨性关节炎的基本病理过程中起着直接促进软骨基质降解及软骨细胞的破坏的作用，同时TNF-α诱导生成IL-6、IL-1β的炎症因子能加重关节滑膜的炎症反应。本研究中我们发现模型组TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均升高；与模型组相比，寄生壮骨颗粒治疗后，TNF-α、IL-6、IL-1β 均有所下降，其中以寄生壮骨颗粒高剂量组治疗效果最为明显。

在骨性关节炎病变过程中，关节软骨的损害首先是软骨细胞外基质中胶原的破坏，且以Ⅱ型胶原为主，在关节软骨退变严重的区域，以胶原酶和基质溶解素等为代表的MMPs类的活性最高[4]，其中MMP-3、MMP-13在骨性关节炎的疾病中表达增高。本文研究表明寄生壮骨颗粒治疗组使MMP-3、MMP-13表达量显著降低。

软骨中蛋白聚糖的合成不足是软骨退变的主要表现之一，而糖胺多糖是蛋白聚糖的最主要成分[5]。实验结果显示寄生壮骨颗粒能显著提高组织中糖胺多糖的含量。

综上所述，寄生壮骨颗粒在减轻木瓜蛋白酶诱导大鼠骨关节炎的同时，降低TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-3、MMP-13的表达，提高糖胺多糖含量。提示寄生壮骨颗粒治疗木瓜蛋白酶诱导大鼠骨关节炎可能是从下调促炎因子的表达、抑制金属蛋白酶产生、增加糖胺多糖的含量来治疗骨关节炎。关于寄生壮骨颗粒在减轻木瓜蛋白酶诱导大鼠骨关节炎的机制有待进一步深入研究。