新疆昆仑雪菊总黄酮紫外分光光度法含量测定的适应性研究

赵 元，高 雅，陈新梅，徐爱萍，丁志远

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

雪菊是菊科金鸡菊属两色金鸡菊(CoreopsistinctoriaNutt.)的干燥头状花序[1]，含有300多种成分[2]，总黄酮为主要活性成分，具有降血脂、降血压、抗衰老等作用。总黄酮含量测定多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法，该法不仅黄酮类在碱性环境下能显色，而且含有邻二酚羟基的酚酸类也能显色，使结果偏高[3]。因此选择适合的显色法具有重要意义。本实验采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法、AlCl3-KAc显色法、三乙胺显色法分别测定总黄酮含量，优选最佳方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UV-5100紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；FA1004电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司) 。

1.2 药品与试剂

药材：雪菊(新疆华草医药科技有限公司，批号：20171026)，经山东中医药大学药学院徐凌川教授鉴定为菊科金鸡菊属两色金鸡菊(CoreopsistinctoriaNutt.)的头状花序。

试剂：芦丁标准品(上海源叶，批号：Y06J8S37439，纯度≥98%)。三乙胺(天津科密欧，批号：20150420)；亚硝酸钠(国药集团，批号：20160509)；硝酸铝(天津科密欧，批号：20131107)；氢氧化钠(天津福晨化学试剂厂，批号：20161008)；三氯化铝(国药集团，批号：20141215)；乙酸钾(天津科密欧化，批号：20170710)。

2 方法与结果

2.1 芦丁对照品溶液的配制

精密称取芦丁对照品10.20 mg，甲醇微热溶解，冷却至室温，加入甲醇至刻度，配制成0.19996 mg/mL的对照品溶液。

2.2 雪菊样品溶液的制备

称取1.00 g雪菊，加入纯化水40 mL，100 ℃浸渍20 min，浸渍3次，滤过，合并滤液，置100 mL容量瓶中，定容至刻度。

2.3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法

精密吸取芦丁对照品溶液与样品溶液各1 mL，按照NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法显色[3]，紫外分光光度计于350～800 nm进行扫描，确定509 nm为检测波长[3]。回归方程为A=0.0134C-0.0144，r=0.9997，芦丁对照品溶液在8.00～47.99 μg/mL范围内线性关系良好。精密度(RSD为3.81%)、3 h内稳定性(RSD为1.86%)、重复性均良好(RSD为3.59%)，平均加样回收率为102.04%，RSD为2.38%。

2.4 AlCl3-KAc显色法

精密吸取芦丁对照品溶液与样品溶液各1 mL，按照AlCl3-KAc显色法显色[4]，紫外分光光度计于350～800 nm进行扫描，确定431 nm作为检测波长[4]。回归方程为A=0.0401C-0.0216，r=0.9999，芦丁对照品溶液在4.00～24.00 μg/mL范围内线性关系良好。精密度(RSD为1.34%)、重复性均良好(RSD为2.23%)，3 h内稳定性较差(RSD为9.70%)，平均加样回收率为100.46%，RSD为3.40%。

2.5 三乙胺(TEA)显色法

精密吸取芦丁对照品溶液与样品溶液各1 mL，按照三乙胺显色法显色[5]。紫外分光光度计350～800 nm进行扫描，确定415 nm作为检测波长[5]。回归方程为A=0.0272C-0.0028，r=0.9996，芦丁对照品溶液在4.00～24.00 μg/mL范围内线性关系良好。精密度(RSD为2.32%)、3 h内稳定性(RSD为2.30%)、重复性均良好(RSD为2.86%)，平均加样回收率为102.28%，RSD为2.82%。

2.6 雪菊总黄酮含量的测定

吸取2.2项下样品溶液1 mL，分别按2.3、2.4、2.5项下测定，结果见表1。

表1 总黄酮含量(n=3)

3 讨论

(1)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法的原理是亚硝酸钠先还原黄酮，被还原的黄酮与 Al3+络合，加入NaOH造成碱性环境使C环开环生成查尔酮显红橙色[6]，含有邻二酚羟基的酚酸类、木脂素类成分也能被显色，使结果偏高。但采用该法测定时显色明显，并且赵美等[7]采用该法测定金莲花总黄酮时的精密度、重现性、加样回收率较好，可能是目前此法运用较多的原因。本实验采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测得的总黄酮含量为19.67%，与王家妮[8]利用此法测定的新疆昆仑雪菊总黄酮含量(20.39%)基本一致。

(2)AlCl3-KAC显色法原理为Al3+与黄酮的3-羟基4-羰基、5-羟基4-羰基及B环邻二酚羟基发生络合，使黄酮的紫外吸收谱带Ⅱ红移至420 nm，对于含有邻二酚羟基的酚酸类化合物显色前后在420 nm处无吸收[9]。本实验采用AlCl3-KAc显色法测得的总黄酮含量为3.17%，避免了酚酸类化合物的影响。但是，180 min内稳定性的RSD为9.70%，稳定性较差，随时间的延长有结晶析出，推测可能是此原因影响了稳定性。60 min内稳定性的RSD为0.92%，90 min内稳定性的RSD为3.71%，在采用本法时应在60 min内完成。

(3)三乙胺显色法主要是以芹菜素为母核的黄酮及其苷类成分显色，因此雪菊中部分黄酮不能被显色。本实验采用三乙胺显色法测得总黄酮的含量与AlCl3-KAc显色法测得总黄酮含量相近。三乙胺显色法测定总黄酮含量时，只需加入一种显色剂，具有操作简单、误差小的优点，同时方法学结果均优于其他两种方法。综上所述，建议在测定雪菊总黄酮含量时使用三乙胺显色法。