水稻—油菜轮作土壤拮抗立枯丝核菌的筛选和鉴定

杨敬林，张立成，廖健程，丁 鑫，程 哲，罗东城

(1.湖南农业大学工学院，湖南 长沙 410128；2.福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建 福州 350013；3.南方粮油作物协同创新中心，湖南 长沙 410128)

【研究意义】土传病菌是土壤中一类对作物有致病害作用的微生物，该类微生物由土壤传染至作物从而引起作物发病被称之为土传病菌[1]。引起作物土传病害的病原物种类很多，包括真菌、细菌、线虫和放线菌等，主要为真菌类微生物[2]。这些病原物能在土壤中快速繁殖生长，当土壤中病原微生物较多时，其通过作物根系侵入植株体内。立枯丝核菌是水稻连作土壤中常见的一类土传病菌，不同作物之间的轮作栽培可以有效减轻这类土传病的致病害作用[3]。利用自然环境中对土壤病原菌具有抗生、营养和竞争作用的微生物菌株进行作物病害的生物防治的重要措施。拮抗微生物具有抑菌效果稳定和抑菌机理多样性特征，筛选和鉴定出拮抗病菌功能的微生物菌株在植物病害生物防治中发挥着重要作用。【前人研究进展】土传病害常发生在作物连作栽培之后，例如，西瓜连作栽培易发生枯萎病，小麦连作栽培后土传花叶病指数增加[4-5]。而通过轮作栽培可有效减轻作物的土传病害作用，刘星以马铃薯—玉米轮作和马铃薯连作栽培进行比较试验，发现连作土壤中对马铃薯具有致病作用的镰刀菌属类微生物相比轮作土壤的数量显著增加[6]。连作栽培对根际土壤中微生物群落结构的影响是导致连作障碍的一个重要因素。Lang等人在棉花上的研究证明连作条件下微生物群落结构变化与土传病害发生存在直接关系[7]。轮作可以减少土传病害影响，在多类作物栽培实践中得以验证。目前对于轮作减轻土传病害的机理尚不完全清楚，一般认为轮作维持土壤微生物多样性平衡，控制土传病菌的数量，也有学者指出轮作能够降低土传病菌在土壤中的富集[8-9]。轮作栽培后土壤中存在与土传病菌相拮抗的微生物是土壤微生物多样性平衡理论之一[10]。土壤为微生物生长提供良好的环境条件及养分资源，不同种类微生物为维持微生态系统平衡存在着相互拮抗作用[11]。相关学者在作物病害的生物防治研究中发现水稻连作易使其感染纹枯病，一种由立枯丝核菌引起的病害，而水稻和其它类别的作物轮作栽培则能减少纹枯病菌染病指数[12-13]。【本研究的切入点】我国南方地区多年的水稻—油菜轮实践生产上，该种植方式下作物生长良好，作物发生土传病害的染病指数较低。水稻—油菜轮作是一种水旱轮作方式，轮作后根际土壤微生物群落结构特征不同[14]。利用植株上附生或根际土壤中的拮抗细菌调控有害微生物的平衡，是有效防控土传病的生物防治途径。【拟解决的关键问题】本研究利用长期水稻-油菜轮作土壤中筛选出拮抗立枯丝核菌的有益微生物菌株及其拮抗细菌生理特征和分类进行鉴定，通过本研究以期为水旱轮作栽培生物防治土传病害提供理论上的参考作用和菌株资源。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌株和培养基

供试病原菌：立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)由湖南农业大学植物保护学院提供。

NA培养基：牛肉膏3 g，酵母膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂18 g，水1000 mL，pH 7.0。该培养基用于培养土壤分离细菌类微生物。

PDA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂18 g，水1000 mL，pH 7.0。该培养基用于培养病原真菌微生物。

图1 安仁县渡口乡定位试验田轮作和连作分区Fig.1 Lactation test field of rotation and continuous partition in Dukou village, Anren country

1.2 水稻-油菜轮作土壤微生物菌株的分离

试验采集土壤来自于湖南省安仁县渡口乡(26°17′N、113°27′E)，长期(30年)进行水稻—油菜轮作的定位实验田。试验小区布置于图1所示，左边3个试验小区为“稻-稻”连作，右边3个试验小区为“稻-稻-油”轮作 。将采集的新鲜土壤样品用灭菌勺挖取一小勺放入装有100 mL灭菌水的三角瓶中振荡均匀，再从中吸取液体稀释至10-6倍，最后吸取稀释液0.1 mL均匀涂布在NA培养基上置于培养箱中培养72 h。培养完成后从平板中挑取不同类型的菌落在斜面上划线纯化保存备用。

1.3 立枯丝核菌拮抗菌的筛选

拮抗菌的粗筛：将立枯丝核菌病原菌接种至PDA培养基，用无菌水冲洗培养基表面菌群分生孢子，再通过无菌棉过滤配制成孢子悬液。取100 μl立枯丝核菌的孢子悬液均匀涂布在PDA培养基上，静置培养24 h后用灭菌竹签挑取“稻-油”轮作土壤分离的菌株进行接种。接种完成后，将PDA平板置于30 ℃恒温培养箱中培养96 h后观察菌落特征并测定接种分离菌株产生的抑菌圈大小。

拮抗菌的复筛：筛选出具有明显抑菌效果的菌株，采用平板对峙法对拮抗立枯丝核菌进行复筛，对拮抗效果较好的菌株进行后续试验鉴定。

1.4 菌株鉴别

试验采用细菌培养基分离土壤微生物菌株，对分离出的拮抗病菌采用试剂盒法提取出DNA后再用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增，扩增片段长度约为1.4 kb。引物序列F: 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，R: 5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3’。引扩增程序为: 94 ℃预变性3 min，94 ℃变性 40 s，65 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，30个循环， 最后72 ℃延伸8 min。引物合成和测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。然后对扩增产物进行基因序列测定，将测序结果与GenBank数据库中相似序列选用Blast方式进行片段相似性比对。用 DNAMAN 软件将供试菌株的核糖体 16S rDNA序列与 GenBank 中的相关菌株进行序列同源性比对。

土壤筛分出的微生物菌株生理生化指标测定方法参照咸洪泉[15]编写的《微生物学实验教程》。

2 结果与分析

2.1 水稻—油菜轮作土壤拮抗立枯丝核菌初筛

应用稀释涂平板法从水稻—油菜轮作实验田土壤样品中分离出77株菌，分别编号为1～77#。接种菌株后初步筛选出能在培养立枯丝核菌平板上产生菌圈直径4 mm以上的菌株有21株，各菌株的菌圈直径大小如图2所示。应用平板对峙法进行复筛出对立枯丝核菌产生显著拮抗作用的菌株有4株，菌株编号分别为4#、31#、36#、52#。

2.2 水稻-油菜轮作土壤拮抗立枯丝核菌的分子生物学鉴定

将 4株明显具有拮抗立枯丝核菌的菌株进行16S rDNA基因片段PCR扩增，然后纯化扩增产物对其测序。通过对菌株PCR产物DNA片段序列的测定，4株抗土传病菌株序列长度相近，约为600 bp，但是组成DNA的碱基序列不同。把这些DNA片段测序结果输入NCBI核酸数据库进行Blast比对。应用Mega软件将NCBI数据库中的比对结果进行分析，所构建拮抗菌种属关系的系统发育树(N-J邻接法)如图3 所示。从该系统发育树可以看出36#菌株和52#菌株构成一个小分支属于一类微生物，4#菌株和31#菌株构成另一个小分支属于一类微生物。36#、52#菌株与已鉴定出的菌株Bacillussubtilisstrain(枯草芽胞杆菌株)(登陆号：KX950669.1)和Bacillusvietnamensisstrain V21.33(越南芽胞杆菌种)(登陆号：KT720293.1)的种属关系相近。4#、31#菌株与已鉴定出的菌株Bacillussp. oxC partial(芽胞杆菌oxC部分序列)(登陆号：AJ697957.1)和UnculturedBacillussp. clone TOPO1(芽胞杆菌的克隆培养TOPO1序列)的种属关系相近。运用DNAMAN软件对序列进一步分析，得出36#和52#菌株的同源性达97.8 %，因此可以认为从土壤中筛分出的两株抗土传病菌属于同种微生物。相同的分析方法得出4#和31#菌株的同源性达98.5 %，这2株抗土传病菌株也属同种微生物。系统发育树并没有将4株待鉴定微生物菌株与已知菌株单独构成一个分支，根据发育树分支的相近性，可初步鉴定出36#和52#菌株属枯草芽胞杆菌种，4#和31#菌株属芽胞杆菌属类微生物未鉴别种。

图2 “稻-油”轮作土壤筛分的拮抗立枯丝核菌Fig.2 The isolated antagonistic Rhizoctonia solani of soil under rice-rape rotation

2.3 水稻-油菜轮作土壤拮抗立枯丝核菌的形态学和生理生化鉴定

筛选的4株菌株经革兰式染色均呈阳性，其中4#和31#菌株所形成的菌落表面凸起边缘光滑，菌落中心处为白色，四周为淡黄色，边缘不规则。通过显微镜观测4株菌的细胞呈直或弯曲杆状，有鞭毛，无荚膜。从菌落特征和革兰式染色观察4株菌无明显差异特征，说明这4株菌具有较高的相似性，其特征与芽胞杆菌属微生物的形态学特征相符。

如表1所示，其中4#和31#菌株的生理生化功能特性相同，36#和52#菌株生理生化功能特性相同。这和前面的分子生物学分类结果相同，表明4#菌株和31#菌株是同一种菌株，36#菌株和52#菌株是同一种菌株。4#菌株和31#菌株的吲哚试验、V-P试验、苯丙氨酸脱氢酶试验、精氨酸双水解酶试验、硫化氢试验检测结果为阴性，其余指标检测结果为阳性。36#菌株和52#菌株的V-P试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、硫化氢试验检测结果为阴性，其余指标检测结果为阳性。4株菌株在盐度小于8 %条件下均能正常生长，盐度大于12 %时生长受限。根据4#菌株和31#菌株的生理生态特性鉴定可鉴定为弯曲芽胞杆菌，36#菌株和52#菌株的生理生态特性鉴定可鉴定为枯草芽胞杆菌。

3 讨 论

水稻和油菜轮作栽培是我国南方地区常见的一种栽培方式，已有研究报道长期的轮作对土壤微生物群落特征有显著的影响[16-17]。本研究是根据微生物之间存在不同菌类的相互拮抗作用这一理论从水稻-油菜轮作土壤中筛选出拮抗立枯丝核菌的有益微生物菌株，并对菌株种属类别进行鉴定。土壤中微生物种类非常丰富，既有对作物产生有利作用的促生长菌也有对作物有害的致病菌[18]。立枯丝核菌属于真菌类微生物，其对多种作物产生危害作用，尤其对水稻的致病作用较强，其致病机理是该病菌可以产生内毒素，抑制植物细胞的生长或使细胞过早死亡[19]。目前对该类病的防治主要是通过化学杀菌剂将病菌杀死，但化学杀菌剂除了杀灭病菌外，自身也会残留在土壤中被作物吸收利用后将影响农作物品质安全[20]。而生物防治是一种对环境友好，有效减少作物土传病害的方法。生物防治的基本特点是在土壤中形成一定数量的抗病菌类微生物，以优势菌种在土壤中生存进而抑制有害病菌在土壤中的积累[21-22]。水稻—油菜轮作栽培下作物根际圈存在不同种类的微生物与根系之间的交互作用，微生物群落结构会随栽种物不同而发生变化[23]。连作土壤中由于单一作物根系与土壤微生物交互作用，微生物群落结构稳定，有害病菌容易积累，当其数量在土壤微生物中达到一定比例时则会引发作物土传病菌[24]。轮作后不同作物的根系分泌物有益于自身作物根际圈微生物的生长，而对别的作物根际圈微生物生长产生拮抗作用[25]。本试验虽然已鉴别出水稻—油菜轮作土壤中存在弯曲芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌两类具有抗立枯丝核菌的有益菌株，但对于有益菌株与有害菌株之间的拮抗作用机理有待进一步深入研究。

图3 拮抗立枯丝核菌分子生物学的种属鉴定Fig.3 Species identification by molecular biology for soil borne pathogens

表1 抗土传病菌株生理生化鉴定结果

4 结 论

本研究是从长期水稻—油菜轮作试验田采集土壤样品，筛分具有拮抗立枯丝核菌的微生物菌株。结果发现，有4株明显具有拮抗立枯丝核菌的微生物菌株，经过分子生物学和生理生态鉴定，这些菌株均为芽胞杆菌属，其中2株为弯曲芽胞杆菌，另外2株为枯草芽胞杆菌。