酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼生长、非特异性免疫及肠道结构的影响

陈福艳，欧阳贤华，黎建斌 ，黄彩林，李大列，雷爱莹，黄 婷，黎 铭 *，梁万文 *

(1. 广西水产科学研究院/广西遗传育种与健康养殖遗传重点试验室，广西 南宁 530021； 2. 广西芳草安桂生物科技有限公司，广西 南宁 530001；3. 广西壮族自治区水产引育种中心，广西 南宁 530031)

【研究意义】罗非鱼是全球养殖最广泛的淡水鱼类之一，具有适应能力强、生长快速、养殖周期短、易于饲养、出肉率高、无肌间刺、蛋白质丰富和肉质鲜美等优点[1]。我国的罗非鱼养殖经过多年的发展已具规模，但随着罗非鱼养殖规模的扩大和养殖密度的增加，养殖环境恶化的问题日趋严重，罗非鱼病害频繁爆发，如链球菌病、肝胆病、车轮虫病和肠炎等，给罗非鱼养殖业造成了较大经济损失[2]。近年来，罗非鱼还出现肠道方面的问题，如拉长条形带粘膜的粪便，中后肠道透明易破裂，和消化不良等症状，这些症状一般会影响罗非鱼生长，严重的还会导致死亡[3-4]。目前罗非鱼的病害防治主要依赖抗生素，然而大量使用抗生素带来了细菌耐药性和药物残留等问题。因此研究多糖和中草药等天然药物或免疫增强剂，提高罗非鱼的抗病能力，促进生长，是当前罗非鱼养殖业研究的重要方向。【前人研究进展】酵母多糖是酵母菌和真菌细胞壁的重要组成部分，主要由β-葡聚糖、甘露寡糖和糖蛋白等物质组成[5]。大量研究表明，酵母多糖具有促进生长、增强机体免疫、抗病毒和抗肿瘤等生物学功能[6]。中药是人类使用历史悠久的天然药物，含有多种可增强机体的免疫功能的有效成分。中药具有资源丰富、毒副作用小、抗药性不显著、以及性能多样等优点,并含有多种增强机体免疫机能的活性成分，可根据需要配伍成多种复方，使其在临床上的应用具有广泛性和选择性[7]。有研究表明，在饲料中添加酵母多糖可提高多种鱼类的免疫力，包括赤眼鳟[8]、鲤鱼[9]、斑点叉尾鮰[10]、黄颡鱼[11]、草鱼[12]等。王中清等[13]研究发现在饲料中添加酵母多糖可以提高鲫鱼血清AKP与SOD活力，用嗜水气单胞菌攻毒结果试验组鲫鱼感染率均低于对照组的感染率。关于中草药提高鱼类免疫功能的研究报道也比较多，例如：温周瑞等[14]将杜仲、当归、黄芪、枸杞等10味中草药均匀粉碎后配制成复方制剂添加到饲料中投喂罗非鱼，发现可以提高罗非鱼的非特异免疫力。刘红柏等[15]在饲料中分别添加黄芪、茯苓、鱼腥草和板兰根均可使鲤鱼的白细胞吞噬率、吞噬指数和红细胞C3b受体花环率升高。曲亚玲等[16]研究发现在虹鳟鱼饲料中添加中草药复合添加剂富康163能促进虹鳟鱼体生长,提高营养物质利用率。张耀武等[17]研究发现基础饲料中添加成分为黄芩、茯苓、板蓝根、黄芪、大黄、甘草、金银花的复方中草药制剂，可显著提高黄颡鱼生长、血细胞的吞噬活性、溶菌酶活力。冯娟等[18]研究发现在饲料中添加板蓝根、大青叶、连翘、黄芪、藿香和沙打旺等组成的中草药混合剂可有效提军曹鱼稚鱼的溶菌酶活力和白细胞杀菌活力，降低鲨鱼弧菌对军曹鱼的致死率。邢玉娟等[19]研究发现，在基础饲料中添加成分为黄芪、甘草、板蓝根、大青叶等的复合中草药可提高草鱼的白细胞吞噬能力、组织溶菌酶及超氧化物歧化酶活性，增强非特异性免疫功能。曲木等[20]研究发现，用含黄芪、党参、野菊花的复方中草药的饲料饲喂黄颡鱼后，试验组黄颡鱼增重率、特定生长率显著升高，饵料系数显著降低，组织中补体C3和补体C4含量明显增高。这些研究发现在鱼类饲料中添加酵母多糖或中草药制剂均可提高鱼类的非特异性免疫功能，提高鱼类抗病能力，因此建议在养殖饲料中添加加酵母多糖或中草药制剂。【本研究切入点】目前尚未有酵母多糖对罗非鱼生长和免疫功能影响的研究报道，未有酵母多糖或中药对鱼类肠道结构的影响的研究报道，也未有酵母多糖-中药复合制剂对鱼类生长和免疫功能的影响的研究报道。【拟解决的关键问题】以罗非鱼为研究对象，探讨酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼生长、非特异性免疫及肠道结构的影响，为罗非鱼的健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 制剂制作

酵母多糖产品购于安琪酵母股份有限公司，成分：水分≤8.0 %，甘露聚糖≥20.0 %，β-萄聚糖20.0 %～35.0 %，溶解率≥45.0 %；黄芪多糖免疫草产品购于成都芳水生物科技有限公司，主要成分：黄芪多糖提取粉、甘草、绞股蓝等；鱼腥草和甘草等中草药购自南宁市某药店，产自广西。酵母多糖-中草药复合制剂组方经过药师指导设计和预备试验筛选，主要成分为酵母多糖45 %、鱼腥草35 %、甘草15 %和黄芪多糖5 %。酵母多糖-中草药复合制剂的制备方法为：中草药分别用破壁机粉碎成60目粉剂，然后按比例混合，用开水浸泡30 min浸出有效成分，水的添加量为饲料量的5 %，然后按比例加入酵母多糖，搅拌均匀，3～10 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验设计

试验用鱼来源于南宁亭子鱼苗市场，为海南宝路罗非鱼。试验开始前暂时(15 d)养殖于广西水产科学研究院水簇楼的1 m3塑料桶中，每个桶配充气头2个，养殖用水为经过曝气的自来水。

试验鱼共240尾，分为对照组、0.05 %组、0.1 %组和0.2 %组，每组试验鱼包含3个生物学重复，每个重复20尾鱼(表1)。对照组罗非鱼投喂基础饲料。基础饲料是百洋集团生产的罗非鱼颗粒饲料(402#)，成分：粗蛋白30.0 %，粗脂肪3.0 %，粗纤维10.0 %，粗灰分13.0 %，水分12.0 %，赖氨酸1.4 %，钙0.5 %～2.5 %，总磷0.6 %～2.0 %，氯化钠0.3 %～1.5 %。试验组罗非鱼的基础饲料中添加不同比例(表1)的酵母多糖-中草药复合制剂及0.2 %粘合剂搅拌均匀。试验开始后，养殖期间每天投喂2次，时间分别为早上8:00，下午5:00，投喂量约为鱼体重的2 %。试验时间为56 d。对照组罗非鱼一直投喂基础饲料；试验组罗非鱼一直投喂添加酵母多糖-中草药复合制剂的饲料，每逢周日停止添加酵母多糖-中草药复合制剂1 d，改为投喂基础饲料。试验期间，下午投喂饲料30 min后捞养殖水体中的残饵，吸除粪便，加注新水；定期监测水质pH值、氨氮和亚消酸盐，视水质情况更换水量。

表1 试验鱼分组

1.3 样品采集

试验结束后，将试验鱼饥饿24 h后，对每桶鱼进行称量计数，计数存活和增重率。随机抽取每桶试验鱼15尾鱼，用MS-222麻醉后，进行各项检测。其中6尾用于抽血，另外6尾鱼用于测量体重，另外剪取3尾鱼的前肠1.0 cm，置于10 %甲醛短暂(24 h内)固定，用于制作组织切片[21]。

抽血：采用尾静脉抽血，轻缓操作，防止细胞破裂。制成凝血，即将抽取的血液置于无菌真空离心管，置于4 ℃冰箱静释4 h后，4000 r/min离心10 min，取上清液，分装于2 mL离心管，-80 ℃保存备用，作为血清生化指标和各种酶的测定[22]。

1.4 生长性能的测定

实验罗非鱼的生长性能测定参照文献的方法进行[21]。

增重率(%)={[末体重(g)-初体重(g)]/初体重(g)}×100

特定生长率(%)={[ln末体重(g)-ln初体重(g)]/时间(d)}×100

饲料系数=摄食饲料总量(g)/[末体重(g)-初体重(g)]

存活率(%)=(成活尾数/总尾数)×100

1.5 血清生化指标的测定

主要测定总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆固醇、谷草转氨酶、甘油三酯及谷丙转氨酶等指标的含量，使用日立7020型全自动生化分析仪进行测定。

1.6 血清抗氧化指标的测定

血清中的抗氧化指标主要测定了总抗氧化能力、过氧化氢酶活性、丙二醛含量和一氧化氮含量，均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒根据说明书的方法进行测定。

1.7 血清免疫指标的测定

血清免疫指标主要测量补体C3、补体C4、溶菌酶和淀粉酶。血清中的补体C3和补体C4使用上海酶联生物技术有限公司试剂盒根据说明书的方法进行测定；血清中溶菌酶和淀粉酶活性使用南京建成生物工程研究所试剂盒根据说明书的方法进行测定。

1.8 肠道结构的显微镜观察

采用常规方法对肠道组织进行石蜡包埋，切片(7 μm)，苏木精-伊红染色。在Olympus CX41显微镜下观察，用明美显微数码测量分析系统进行拍照及测量，每具肠管取2张切片，每张切片选取3个绒毛高度和肌层厚度进行测量[21]。

1.9 统计分析

采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼生长性能、饲料利用率和成活率的影响

由表2可见，各组随着添加比例的提高增重率和特定生长率都有所提高，其中0.20 %组的增重率和特定生长率显著高于对照组、0.05 %组和0.10 %组(P<0.05，下同)，但对照组、0.05 %组和0.10 %组间增重率和特定生长率差异不显著(P>0.05，下同)；0.20 %组的饲料系数随着复合制剂的投喂量的增加而降低，其中0.20 %组的饲料系数显著低于对照组、0.05 %组和0.10 %组，但是对照组、0.05 %组和0.10 %组间饲料系数差异不显著。4组罗非鱼的存活率均为100 %。

表2 酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼生长性能、饲料利用率和成活率的影响

注：表中数据为平均值±标准差。同行数据后上标不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note： Data in the table is expressed as mean ± standard deviation. Values with different superscripts lowercase letters in the same column are significantly different (P<0.05). The same as below.

2.2 酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼血清生化指标的影响

由表3可见，白蛋白含量、谷草转氨酶浓度和谷丙转氨酶浓度随着添加比例的提高有所增加；其中0.20 %组的白蛋白含量、谷草转氨酶浓度和谷丙转氨酶浓度含量显著高于对照组、0.05 %组和0.10 %组，而对照组、0.05 %组和0.10 %组间差异不显著；0.05 %组的甘油三酯浓度显著低于对照组，而其他各组间差异不显著；另外总蛋白含量、球蛋白含量、总胆固醇浓度3个指标在各组间的差异不显著；0.05 %组的淀粉酶活性与对照组差异不显著，而0.10 %组和0.20 %组的淀粉酶活性显著高于对照组和0.05 %组。

2.3 酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼血清抗氧化能力的影响

由表4可见，总抗氧化能力浓度和过氧化氢酶在试验组中随着添加比例的提高有所增长的趋势，而一氧化氮为降低的趋势。其中0.20 %组的总抗氧化能力浓度显著高于比对照组和0.10 %组；0.20 %组、0.05 %组过氧化氢酶浓度显著高于对照组和0.10 %组；而0.05 %组、0.10 %组和0.20 %组的一氧化氮浓度显著低于对照组的，但是丙二醛各组间的差异不显著。

2.4 酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼免疫指标的影响

由表5可见，试验组的补体C3浓度、补体C4浓度活性和溶菌酶活性随着添加比例的提高增加有所增长的趋势。其中0.05 %组、0.10 %组和0.20 %组的补体C3浓度显著高于对照组；0.10 %组和0.20 %组的补体C4浓度显著高于对照组和0.05 %组，而0.05 %组的补体C4浓度与对照组差异不显著；0.05 %组、0.10 %组的溶菌酶活性显著高于对照组和0.20 %组，而0.20 %组的溶菌酶活性与对照组差异不显著。

表3 酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼血清生化指标的影响

表4 酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼血清抗氧化能力的影响

表5 酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼免疫指标的影响

2.5 酵母多糖-中药复合制剂对罗非鱼肠道结构的影响

对罗非鱼的肠道进行切片和显微镜观测(图1)，结果表明，在饲料中添加酵母多糖-中药复合制剂可对罗非鱼肠道结构产生影响，肠道绒毛高度随着添加量的增加而增长，其中试验组肠道绒毛高度显著长于对照组；肠道肌层厚度也随着添加量的增加面增厚，但各组间差异不显著(表6)。

3 讨 论

已经有一些研究发现，在饲料中添加酵母多糖可以提高动物的非特异性免疫功能，促进生长发育[22]，也有研究发现在饲料中添加中草药可以增加动物的机体免疫功能，提高抗病能力[23]。然而，至今还没有将酵母多糖和中草药配伍成酵母多糖-中草药复合制剂用于饲料添加剂的研究报道。

生长性能和饲料利用率是养殖动物重要的性状，直接影响到养殖的经济效益。已经有研究发现，在饲料中添加0.1 %的酵母多糖可以提高鲤鱼的相对增重率和摄食速度[9]，还有研究发现，在饲料中添加酵母多糖可以促进丰产鲫的生长[24]。还有一些研究表明，在饲料中添加中草药能够促进美国红鱼[25]、黄颡鱼[17]和草鱼[26]的生长。本研究发现在罗非鱼饲料中添加酵母多糖-中草药复合制剂能有效提高罗非鱼的增重率、特定生长率和降低饲料系数。但是各组的成活率差异不显著，主要原因是试验鱼的数量较少，试验期间没有鱼死亡，成活率都是100 %，因此显示不出差别。

A：对照组肠道结构；B：0.05 %组肠道结构；C：0.10 %组肠道结构；D：0.20 %组肠道结构；HM：绒毛高度；HC：肌层厚度A: Intestinal structure chart of control group; B: 0.05 % group; C: 0.10 % group; D: 0.20 % group; MH: Villus height; HC: Muscle thickness图1 试验鱼肠道组织结构(100倍显微镜)Fig.1 Histological chart of intestinal structure of experimental fish (100-fold microscopy)

表6 酵母多糖-中草药复合制剂对罗非鱼肠道结构的影响

血清生化指标和抗氧化能力是衡量动物健康状况和免疫功能的重要标志。张雪等[27]研究发现在饲料中添加果寡糖和甘露寡糖可以提高大菱鲆幼鱼血清的总蛋白含量，降低甘油三酯含量，提高大菱鲆对营养物质的吸收,促进蛋白质和脂类代谢[26]。谷丙转氨酶和谷草转氨酶是肝细胞受损最灵敏指标，可以用来评价药物的毒副作用。陈玉春等[28]研究发现在饲料中分别添加刺五加、蒲公英、枸杞子、金银花和大蒜单方中草药对鲤鱼血清的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性影响不显著，说明这些中草药的毒性不大[28]。本研究在罗非鱼饲料中添加酵母多糖-中草药复合制剂，结果发现能提高罗非鱼血清中的白蛋白、总抗氧化能力和过氧化氢酶，而对0.05 %组和0.1 %组的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的提高不明显，与其他学者的研究报道类似。但是，血清中的总蛋白、球蛋白、总胆固醇和丙二醛等指标的差异不显著，这可能与制剂的配方以及添加的比例有关，有待将来进一步研究。

补体是存在于动物血清和组织液中的一组不耐热的经活化后具有酶活性的蛋白质。溶菌酶是一种能水解病原微生物细胞壁中黏多糖的碱性酶。补体和溶菌酶都属于非特异性免疫功能蛋白，在鱼类抵抗病原微生物入侵中发挥着很重要的作用[29]。本研究在罗非鱼饲料中添加酵母多糖-中草药复合制剂，结果发现能提高罗非鱼血液中补体和溶菌酶的浓度，而且随着添加比例的提高，补体和溶菌酶的浓度越高。结果说明酵母多糖-中草药复合制剂能有效提高罗非鱼的非特异性免疫功能。

鱼类的肠道对抗病能力和生长至关重要，很多病原微生物都是通过肠道感染鱼。肠道还是鱼类吸收营养物质的主要器官。因此，保持鱼类的肠道结构完整和微生态平衡对鱼的生长发育和健康很重要。前尚未有关于酵母多糖或中草药制剂对鱼类肠道的影响的研究报道，但是已经有一些其它动物这方面的研究。例如，张运涛等[30]研究发现，在仔鸡的饮用水中添加酵母多糖，在大肠杆菌攻毒条件下，对照组小肠绒毛变形、微绒毛脱落，而试验组小肠绒毛和微绒毛生长发育正常。贺琴等[31]研究发现在饲粮中添加酵母壁多糖能够显著提高仔猪空肠绒毛高度和十二指肠绒毛高度。贺永康等[32]研究发现，在饲粮中添加白头翁、黄芪、黄连、党参及大黄等药材组成的中草药添加剂，肉鸡肠道的绒毛高度比对照组提高了8.52 %～23.04 %。本研究在罗非鱼饲料中添加酵母多糖-中草药复合制剂，发现处理组罗非鱼肠道的绒毛高度和肌层厚度都有增加，其中试验组的绒毛高度显著高于对照组。其主要原因可能是酵母多糖-中草药复合制剂提高罗非鱼绒毛的生长性能，改善肠道微生态环境，从而也促进肠道的生长发育，而肠道结构的改善又促进罗非鱼的生长发育，形成良性循环。但本研究只用了2种中草药与酵母多糖配伍成复合制剂，将来有待使用更多的中草药与酵母多糖配伍，探索效果更显著的组方。

4 结 论

在罗非鱼饲料中添加酵母多糖-中草药复合制剂，能有效提高罗非鱼的生长性能和非特异性免疫功能，改善肠道结构。酵母多糖和中草药复合制剂配伍对罗非鱼的生长性能、血清生化指标、血清抗氧化指标、血清免疫指标和肠道结构具有明显的改善作用，能够促进罗非鱼的生长和提高抗病力。