气相色谱法测定泊洛沙姆188中乙二醇、二甘醇和三甘醇含量

雷雅娟，熊晔蓉，朱颜玥，段梦茹，孙春萌，何东升，涂家生

(中国药科大学药学院，药用辅料及仿创药物研发评价中心，南京 210009)

泊洛沙姆(poloxamer)由环氧丙烷和丙二醇反应，形成聚氧丙烯二醇，然后加入环氧乙烷形成嵌段共聚物，其商业化产品泊洛沙姆407的水溶液具有特殊的温度敏感型原位凝胶性质[1]。根据生产过程中环氧乙烷和环氧丙烷相对量的不同，其物理性质和表面活性千差万别。泊洛沙姆188在药物制剂领域应用广泛，通常用作基质、增溶剂、稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、固体分散体载体等[2-5]，以控制药物释放，提高药物的稳定性，增加难溶性药物的溶解度，因而严格控制泊洛沙姆188中有关杂质种类及限度具有重要意义。

在泊洛沙姆188的合成过程中，乙二醇为环氧乙烷的有关副产物，二甘醇、三甘醇为其次级副产物。乙二醇又名甘醇或1,2-亚乙基二醇，是一种多元醇溶剂，为无色无臭、有甜味液体，在肝脏内80%通过乙醇脱氢酶代谢为几种酸代谢物(乙醇酸、乙醛酸、草酸等)[6]。乙二醇对动物有急性毒性，致死剂量约为1.4 mL/kg，其特征为中枢神经系统抑制和人鼠代谢性酸中毒[7]。二甘醇和三甘醇为无色无臭、具吸湿性的黏稠液体，具一定刺激性，对肾脏和神经系统均有毒性[8]。有研究表明，长期使用含二甘醇的制剂能产生经皮毒性并伴随严重的急性肾功能损伤[9]。因此，常用药用辅料泊洛沙姆188中乙二醇、二甘醇和三甘醇的检测对于保证用药安全有效，提高药品质量和安全性都具有重要意义。

《中华人民共和国药典》(2015年版)[10]泊洛沙姆188质量标准中乙二醇、二甘醇检查方法不够完善，存在样品配制方法不合理、样品及对照品溶液浓度低于检测限、高温区保留时间过短等问题。本研究对原有气相色谱方法进行优化，并进行了方法学验证[11-14]。同时，三甘醇为泊洛沙姆188生产中的次级副产物，从生产角度考虑，为严格控制原料有关杂质种类及限度，规范生产标准，相较于现有各国药典，本方法创新性地增加了三甘醇检查，以提高药用辅料质量和安全性。实验结果表明，该方法系统适应性良好，精密度高，加样回收率结果较好，适用于泊洛沙姆188中残留杂质乙二醇、二甘醇和三甘醇的测定，可为保证用药安全有效，进一步控制这3种杂质的残留量提供科学依据[15]。

1 材 料

1.1 药品与试剂

泊洛沙姆188(南京威尔药业股份有限公司，德国巴斯夫股份公司，湖北葛店人福药业有限责任公司)；乙二醇标准品(中国食品药品检定研究院)；二甘醇标准品(中国食品药品检定研究院)；三甘醇、1,3-丁二醇、无水乙醇均为市售色谱级，其余试剂均为市售分析级。

1.2 仪 器

Trace 1300、Trace 1310气相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Omni-A超纯水系统(厦门锐思捷科学仪器有限公司)；KQ-500E超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BSA124S型、SECURA24-1CN型分析天平(德国Sartorius公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及测定方法

色谱柱：Agilent，VF-17ms(30 m×0.53 mm，1.0 μm)，固定相为苯基-聚二甲基硅氧烷(50∶50)。起始温度60 ℃，维持5 min，以10 ℃/min的速率升至100 ℃，再以4 ℃/min的速率升至170 ℃，最后以30 ℃/min的速率升至290 ℃，维持30 min。进样口温度270 ℃，检测器(FID)温度290 ℃。分流进样，分流比10∶1，进样量1 μL。

取供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，按内标法以峰面积计算。

2.2 溶液配制

2.2.1 内标溶液 取1,3-丁二醇适量，精密称定，用95%乙醇溶解并稀释制成1 mL中含0.1 mg的溶液，摇匀，作为内标溶液。

2.2.2 对照品储备溶液 取乙二醇、二甘醇、三甘醇适量，精密称定，用95%乙醇溶解并稀释制成每1 mL中各含0.1 mg的混合溶液，摇匀，作为对照品储备溶液。

2.2.3 对照品溶液 精密移取对照品储备溶液1 mL，置10 mL量瓶中，精密加内标溶液l mL，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液 取本品1.0 g，精密称定，置10 mL量瓶中，精密加内标溶液1 mL，用95%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 系统适应性

取对照品溶液、供试品溶液按照“2.1”项下色谱条件进样，结果表明乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇、三甘醇间分离度均不小于2.0，理论塔板数均大于5 000，保留时间：乙二醇约为4.013 min，1,3-丁二醇约为8.543 min，二甘醇约为11.306 min，三甘醇约为19.437 min。

2.4 专属性试验

专属性要求空白溶剂对乙二醇、二甘醇、三甘醇的含量检测均无干扰，空白溶剂为95%乙醇。取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液按照“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图(图1)，结果表明空白溶剂对乙二醇、二甘醇、三甘醇含量检测均无干扰。

Figure 1 Chromatograms of blank solution (A),reference solution (B) and test solution (C)

1:Ethylene glycol;2:1,3-Butanediol;3:Diethylene glycol;4:Triethylene glycol

2.5 检测限与定量限

将对照品储备溶液逐级稀释至信噪比为S/N=10时的浓度，即为各样品的定量限；信噪比为S/N=3时的浓度，即为样品的检测限。乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇、三甘醇对照品质量浓度(μg/mL)分别为2.112，2.002，2.076时3种物质信噪比均达3，达到检测限；质量浓度(μg/mL)分别为6.336，6.006，6.228时3种物质信噪比均达10，达到定量限。

2.6 线性试验

分别精密移取对照品储备溶液0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL置于5 mL量瓶中，精密加入内标溶液0.5 mL，加95%乙醇定容至5 mL，摇匀，密封，作为1～5线性测试溶液。按照“2.1”项下色谱条件进样，各取样点重复测定3次，根据目标物质峰面积与内标峰面积比值进行计算，所拟合线性回归方程r>0.999，各取样点RSD均不大于4.0%。实验结果见表1。

Table 1 Results of linearity test of three residual impurities (n=3)

Residual impurityLinear range/(μg/mL)Regression equationrEthylene glycol6.336-14.78y=0.065 9x-0.045 10.999 7Diethylene glycol6.006-14.01y=0.064 4x-0.042 90.999 5Triethylene glycol6.228-14.53y=0.067 4x-0.039 80.999 3

2.7 进样精密度

取对照品溶液按照“2.1”项下色谱条件重复进样8次，根据目标物质峰面积与内标峰面积比值进行计算，乙二醇、二甘醇和三甘醇的RSD(%，n=8)分别为3.3、3.0和2.3，表明该方法精密度良好。

2.8 准确度试验

准确度指采用该方法测定的结果与真实值或参考值之间的接近程度，一般用回收率表示，选择回收率溶液浓度为测定浓度的80%、100%和120%。取一批样品(经外标法检测，测本底值)约0.5 g，共9份分为3组(配制方法见表 2)，按照“2.1”项下色谱条件进样，根据目标物质峰面积与内标峰面积比值进行计算，回收率均在85%～110%之间，RSD均小于4%，表明方法准确度良好。具体结果见表3。

Table 2 Preparation method of recovery solution

GroupSample/gReference reserve solution/mL80%0.4100%0.50.5120%0.6Dilute to 5 mL with 95% ethanol

Table 3 Recovery of three residual impurities (n=9)

Residual impurityAverage recovery/%RSD/%Ethylene glycol99.052.9Diethylene glycol102.204.0Triethylene glycol101.913.1

2.9 样品测定

取3个厂家各批次样品按照“2.2”项下方法配制供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，根据目标物质峰面积与内标峰面积比值进行计算，乙二醇、二甘醇和三甘醇均未达检测限，表明3种杂质残留含量均符合规定。

3 讨 论

3.1 溶剂及溶液配制方法

泊洛沙姆188样品在无水乙醇中溶解性差，仅在长时间超声后溶解，且质量浓度为100 mg/mL时溶液不稳定，溶解后易析出，容易堵塞色谱柱；在95%乙醇中，泊洛沙姆188样品无需超声即可溶解，且溶液在低浓度时稳定不易析出，因此改用95%乙醇作为溶剂。气相色谱液体进样时仅要求进样溶液澄清透明，泊洛沙姆188样品在95%乙醇中溶解性好，溶液澄清透明，因此供试品配制过程中无需滤过操作，以简化样品配制过程。

3.2 进样方法

不分流进样时目标峰与杂质峰重合，分离度不足，杂质峰较多，无法进行定量计算。改为分流进样可以得到更好的峰形和分离效果，可进行定量检测。分流比为3∶1和5∶1时乙二醇与杂质峰仍无法完全分离，因此改分流比为10∶1，分离度符合要求，对照均达定量限，杂质峰明显减少，有利于更好地进行定量分析。

3.3 对照品溶液浓度

样品及对照品溶液浓度过低时，广泛使用的气相检测器在规定浓度无法达到检测限。因此参照实验方法，对照品溶液质量浓度为10 μg/mL时，乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇和三甘醇均达定量限，信噪比大于10且峰型良好，因此将对照品溶液质量浓度设为10 μg/mL，样品溶液质量浓度设为100 mg/mL。

3.4 高温区及保持时间

泊洛沙姆188为高分子化合物，残留在色谱柱中易堵塞色谱柱，缩短其使用寿命甚至损坏色谱柱。原标准中采用的对照品及样品浓度较低，泊洛沙姆188含量较少，高温区仅保留2 min。更改实验方法后，泊洛沙姆188浓度提高，因此需要延长高温区保留时间，使高分子样品完全气化，以保护色谱柱。照原药典方法，高温区设置270 ℃时样品杂质无法完全气化，产生的残留影响下次进样，将温度提高至290 ℃后杂质残留明显改善，避免样品间相互影响。

3.5 三甘醇含量的测定

环氧乙烷为泊洛沙姆188的主要合成原料，其水合后生成的乙二醇是其水合过程的主要副产物，占8%～9%；二甘醇、三甘醇为次级副产物，约占1%。因此在现行药典标准检查泊洛沙姆188中乙二醇与二甘醇残留含量的基础上，增加三甘醇残留量的检查，从生产安全角度考虑，严格控制原料有关杂质种类及限度，以提高药品质量和安全性。

4 小 结

本研究从制剂生产及用药安全角度出发，为严格控制原料有关杂质种类及限度，规范生产标准，在现行《中华人民共和国药典》(2015年版)泊洛沙姆188质量标准的基础上，优化了原检测方法，增加了三甘醇的检查。改进后的方法可行性强，乙二醇、二甘醇和三甘醇分离度良好，对泊洛沙姆188生产及质量控制具有重大意义，为保证用药安全有效，进一步控制这3种杂质的残留量提供了科学依据。