清除巨噬细胞加重葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎*

浦佩珉，卞兆连，包元飞，沈健豪，李 民△，顾尔莉

(1.南京中医药大学，南京 210023；2.南京中医药大学南通中西医结合临床医学院/南通市第三人民医院肝病科/肝病研究所，江苏南通 226000)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种以慢性炎性反应和胃肠道上皮损伤为特征的自身免疫性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn′s disease，CD)。虽然目前认为该病的发生主要与饮食、基因及机体免疫等有关[1-4]，但是其具体的发病机制仍不明确。肠道巨噬细胞是肠黏膜抗原呈递细胞的主要种群，它可能通过招募血中单核细胞进入肠道，从而增加促炎因子白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达[5]。由于巨噬细胞能够产生促炎因子来调节炎性反应，因此被认为是IBD破坏性力量的一部分。但是，活化状态下的巨噬细胞也可以产生一些免疫抑制因子，可以帮助修复受损的肠道黏膜组织[6]，且亦有实验表明肠道巨噬细胞可以明显抑制实验性结肠炎[7]，主要通过巨噬细胞中的硒蛋白来保护小鼠免受炎症侵犯[8]。为了研究巨噬细胞在IBD中的作用，本研究使用Clodrolip清除葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠体内的巨噬细胞，以探讨巨噬细胞在UC中的作用，为UC的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 野生型雄性6～8周龄C57BL/6J小鼠，体质量22～24 g，由南通大学动物中心提供，饲养在南通大学无特殊病原体(SPF)级动物房中。动物实验严格遵守南通大学动物伦理委员会要求。

1.1.2试剂 Clodrolip(荷兰Liposoma B.V.公司)；葡聚糖硫酸钠盐(美国MP公司)；人尿粪隐血测试盒(南京建成生物工程研究院)；Ki67抗体(德国Abcam公司)；兔二步法检测试剂盒/兔增强聚合物法检测系统(北京中衫金桥生物技术有限公司)，内含内源性过氧化物酶阻断剂、反应增强液、增强酶标山羊抗兔IgG聚合物；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、粉剂型抗原修复液(柠檬酸法，福州迈新生物技术开发公司)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、蛋白酶K(德国Roche公司)，内含Enzyme Solution、Label Solution、Converter-POD；实时荧光定量PCR(RT-PCR)引物，包括β-actin、IL-1β、IL-6、TNF-α、F4/80[生工生物工程(上海)股份有限公司]；TRlzol试剂、5×PrimeScript RT Master Mix、Prime Script RT Master ExTaqⅡ试剂盒、TB Green Premix ExTaq Ⅱ、RNase Free dH2O(美国TaKaRa公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠UC模型建立及巨噬细胞清除 小鼠UC模型的建立参考文献[9]方法稍做修改。3% DSS用灭菌水配置后除菌过滤。将小鼠随机分为两组，每组5只，两组均予以3% DSS饮用水饲养7 d(7×24 h),DSS+Clodrolip组于造模前3 d、造模当天、造模第2、4、6天腹腔注射200 μL Clodrolip，用于清除小鼠体内及再生的巨噬细胞。每天称重并记录每只小鼠疾病活动指数(DAI)评分，于造模第7天以脱颈法处死小鼠并分离新鲜结直肠及肝脏组织冻存用于RT-PCR检测，或用10%甲醛固定用于苏木精-伊红(HE)染色、免疫组织化学及TUNEL原位细胞凋亡检测；分离小鼠脾脏并称重，评价小鼠炎症情况。

1.2.2DAI评分、结直肠长度测量及脾脏质量称取 实验过程中每天对每组小鼠按照评分标准[10]进行DAI评分，见表1。造模第7天处死小鼠后取出回盲部至肛门的肠段及脾脏，测量整个结直肠长度，称取脾脏质量。

表1 小鼠粪便性状及隐血评分标准

1.2.3结肠病理组织评分 常规石蜡包埋，切片厚度5 μm，HE染色，中性树胶封片后于光镜下按照组织学评分标准[11]从结肠组织炎症程度、病变深度、隐窝损伤及上皮恢复情况进行HE评分。

1.2.4TUNEL原位细胞凋亡检测及DAB染色 常规石蜡包埋切片后鼓风干燥机烤片90 min，使用不同浓度的二甲苯、乙醇梯度脱蜡，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤5 min，2 次，滴加15 μg/mL Proteinase K，21～37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min，3次，滴加50 μL TUNEL反应混合物(按Enzyme solution:Label solution=1∶9配置)，阴性对照组只滴加50 μL Label solution，湿盒中37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤5 min，3次，在组织上滴加1滴PBS，然后在荧光显微镜下观察(激发波长为450～500 nm，发光波长为515～565 nm)，暗绿色颗粒状物质即为凋亡细胞。擦干组织周围，再滴加50 μL Converter-POD，湿盒中37 ℃孵育60 min，PBS洗5 min，3次，随后予以DAB显色50 s，置入自来水中终止显色，苏木精复染11 s，流水冲洗5 min，自然晾干，封片。显微镜下观察，棕黄色颗粒为阳性，并进行半定量积分法[12]。随机观察5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞中阳性细胞的比例。

1.2.5RT-PCR检测结肠组织中炎性因子及肝脏组织中F4/80的表达 于冰上制备肠及肝脏组织匀浆液；根据TRlzol试剂说明书从小鼠结肠组织中提取Total RNA，并用超微量样品分光光度计测定RNA浓度和纯度；根据RNA浓度进行适当稀释后，用5×Prime Script RT Master Mix试剂盒配置RT反应液20 μL[Total RNA:1 000/Total RNA浓度(μL)、5×Prime Script RT Master Mix:4 μL，RNase Free dH2O:16-Total RNA，并将RT反应液在GeneAmp PCR System 9700中反转录成cDNA；于冰上配制PCR扩增反应体系10 μL(cDNA:1 μL，TB Green Premix ExTaq Ⅱ:5 μL，β-actin-F或IL-1β-F或IL-6-F或TNF-α-F:0.4 μL，β-actin-R或IL-1β-R或IL-6-R或TNF-α-R:0.4 μL，RNase Free dH2O:3.2 μL]，在BIO-RAD(CFX Connect Real-Time System)通过RT-PCR扩增cDNA样品。

2 结 果

2.1腹腔注射Clodrolip有效地清除小鼠体内巨噬细胞 为检验小鼠体内巨噬细胞的清除情况，使用RT-PCR检测小鼠肠道及肝脏中F4/80的表达情况。结果显示，DSS+Clodrolip组小鼠肠组织内F4/80相对表达水平(0.023±0.012)较DSS组(0.086±0.028)明显降低(P=0.004)，见图1A；DSS+Clodrolip组小鼠肝脏内F4/80相对表达水平(0.042±0.042)较DSS组(1.068±0.127)明显降低(P<0.01)，见图1B。表明腹腔注射Clodrolip有效地清除了小鼠体内的巨噬细胞。

A:肠道；B:肝脏;a:P=0.004;b:P<0.01
图1两组小鼠组织F4/80表达水平

2.2腹腔注射Clodrolip加重DSS诱导的小鼠结肠炎 为观察腹腔注射Clodrolip对小鼠体质量及DAI的影响，比较两组小鼠每天的体质量变化率及DAI。结果显示，从造模第4天开始，DSS+Clodrolip组小鼠体质量变化率较DSS组明显下降(P<0.05)，见表2；两组小鼠DAI评分显示造模第1天DSS+Clodrolip组小鼠率先出现DAI评分，从造模第4天开始，DSS+Clodrolip组小鼠DAI评分较DSS组明显升高(P<0.05)，见表3。

表2 两组小鼠体质量变化率比较

表3 两组小鼠DAI评分比较分)

2.3两组小鼠结直肠长度以及脾脏质量 两组小鼠结直肠可见回盲瓣肿胀明显，有粪便淤积，DSS+Clodrolip组小鼠结直肠长度[(5.200±0.100)cm]较DSS组[(5.925±0.443)cm]缩短(P=0.042)，见图2。DSS+Clodrolip组小鼠脾脏质量[(0.121±0.031)g]较DSS组[(0.068±0.011)g]增加(P=0.011)，且肉眼可见两组小鼠脾脏大小的差异，见图3。上述结果表明腹腔注射Clodrolip加剧了DSS诱导的小鼠结直肠炎性反应。

为了验证上述结论，将每只小鼠结直肠组织进行HE染色并评分，结果显示，DSS组小鼠结肠组织中度炎症，病变局限在黏膜上层，可见黏膜上层炎性细胞浸润；大部分隐窝结构完整，可见隐窝再生现象；肠上皮完整，大部分组织修复。DSS+Clodrolip组小鼠结肠组织重度炎症，病变累及黏膜下层，可见黏膜层及黏膜下层大量炎性细胞浸润；大部分隐窝结构消失，偶见散在的单个隐窝，无明显隐窝再生现象；肠上皮不完整，大部分肠上皮细胞破坏，无组织修复现象，见图4A。统计结果显示，DSS+Clodrolip组小鼠的组织学损伤评分[(14.683±1.796)分]明显高于DSS组的(8.080±1.404)分(P=0.001)，见图4B。表明腹腔注射Clodrolip加重了DSS诱导的小鼠结肠炎。

A:小鼠结直肠大体；B:小鼠结直肠长度柱状图;a:P=0.004 2
图2两组小鼠结直肠长度

2.4腹腔注射Clodrolip清除巨噬细胞增加了促炎因子的表达 小鼠HE染色结果显示腹腔注射Clodrolip加剧了DSS诱导的肠道炎症，为了探讨其对结肠组织炎性因子的影响，运用RT-PCR方法测定结直肠组织中炎性因子的表达情况，结果显示DSS+Clodrolip组小鼠的IL-1β相对表达水平(1.643±0.616)高于DSS组的0.312±0.273(P=0.002)；DSS+Clodrolip组小鼠的IL-6相对表达水平(4.510±0.411)高于DSS组的0.102±0.171(P<0.01)；DSS+Clodrolip组小鼠的TNF-α相对表达水平(5.403±1.070)高于DSS组的0.494±0.167(P<0.01)，见图5。RT-PCR结果进一步论证了上文的观点。

A:小鼠脾脏外观；B:小鼠脾脏质量柱状图；a:P=0.011
图3两组小鼠脾脏外观及质量

A:小鼠结直肠组织HE染色；B:小鼠结直肠组织的组织学损伤评分；a:P=0.001
图4两组小鼠HE染色病理图片及组织学损伤评分

2.5腹腔注射Clodrolip促进肠黏膜上皮细胞的凋亡 为探究清除巨噬细胞后对小鼠肠黏膜上皮细胞凋亡的影响，使用TUNEL原位细胞凋亡检测法对两组小鼠结肠组织进行细胞凋亡荧光染色及DAB染色，结果显示DSS+Clodrolip组小鼠肠上皮细胞凋亡情况较DSS组明显，见图6；且DAB染色结果显示DSS+Clodrolip组阳性细胞数量比DSS组多，见图7。图6示DSS+Clodrolip组小鼠肠黏膜上皮细胞凋亡增多，以黏膜上皮为主，累及整个黏膜层，而DSS组凋亡相比较少，仅存在于黏膜上皮。

a:P=0.002;b:P<0.01
图5两组小鼠结肠组织促炎因子相对表达水平

图6 两组小鼠结肠组织TUNEL细胞凋亡荧光染色

图7 两组小鼠结肠组织TUNEL法DAB染色

3 讨 论

众多实验论证了免疫细胞在IBD的发病中起重要作用，如Th17细胞及其产生的IL-17大量存在于IBD患者肠道黏膜层，而后者则导致了肠黏膜的损伤，加剧了疾病的活动[13-14]。Th1的极化也与结肠炎症有关，其主要通过诱导干扰素γ(IFN-γ)和TNF-α的产生[15]。而在免疫细胞中，肠道巨噬细胞也扮演着重要的角色，它是肠黏膜抗原呈递细胞的主要种群，决定了T淋巴细胞对肠腔内抗原的反应类型[16]。巨噬细胞作为一种抗原递呈细胞，在调节机体固有和适应性免疫应答中发挥重要作用，且在IBD组织损伤和促进组织修复中发挥重要作用[17-18]，巨噬细胞可以通过释放多种细胞因子和生长因子来促进肠道黏膜的修复[19-20]。而在本实验中，巨噬细胞清除后，肠道黏膜损伤明显加重，表明清除巨噬细胞后影响了其对肠道组织的修复能力，可能延缓了肠黏膜损伤的修复，表现为更加严重的肠道损伤现象。也有研究表明，巨噬细胞与单核细胞相比有更多的抗炎表型，且肠道巨噬细胞在产生炎性细胞因子的能力方面存在严重缺陷[21-22],这与本实验结果相吻合，巨噬细胞清除后炎性因子的表达明显升高。另外在本实验中，清除巨噬细胞以后，肠黏膜上皮细胞凋亡现象也显著增加，表明巨噬细胞清除后肠道炎症损伤加重，巨噬细胞在DSS诱导的UC模型中对肠黏膜起到保护作用，这也与相关报道相吻合[23]。

本研究通过腹腔注射的方法可以有效去除肠道及小鼠体内的巨噬细胞，并且多次给药可以有效清除再生的巨噬细胞，通过RT-PCR检测小鼠肠道及肝脏组织中F4/80的表达水平明确了成功清除巨噬细胞。通过脾脏质量、结直肠长度、DAI指数及病理结果初步揭示了巨噬细胞清除后小鼠肠道炎症损伤加重的现象。通过RT-PCR检测小鼠肠道组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的相对表达水平，结果表明清除巨噬细胞明显上调了小鼠肠道组织促炎因子的表达水平。通过TUNEL原位细胞凋亡检测法进一步揭示巨噬细胞清除后肠上皮细胞凋亡增加的现象。据此，本实验推测巨噬细胞在UC中具有一定的保护作用，清除巨噬细胞后促进了UC小鼠肠道上皮细胞的凋亡及激活促炎因子的高表达来打破肠道促炎抗炎平衡，从而可能导致UC的发展，但其具体的机制有待进一步的研究。