Apocynin通过TGF-β1/Smad信号通路对脂多糖心肌纤维化小鼠的作用及其对ColⅠa1、ColⅢa1的影响

张忠锋，刘鹏，原建华

心肌纤维化（MF）是正常心肌组织中出现以细胞增殖、细胞外基质过度沉积为主要表现的心脏疾病，并且是心源性猝死的主要诱因[1]。研究显示，心肌纤维化与多种疾病密切相关，它是高血压、冠心病、心肌肥厚等多种疾病发展到特定阶段的共同病理改变，同时是心肌重塑的重要表现之一[2]。目前对心肌纤维化的具体发病机制并不十分明确，主要认为多与氧化应激、炎性因子、内皮功能障碍、细胞内钙离子以及体内肾素-血管紧张素-醛固酮系统等存在密切关系[1,3]。

研究表明，在心肌重构及心肌纤维化的过程中氧化应激产生的活性氧显著增多[4]。心肌纤维化患者心肌氧化应激水平明显增加，可能与心肌纤维化患者体内NADPH氧化酶（Nox）活性升高有关[5]。同时动物实验证明Nox在心肌肥厚、心肌梗死、高血压病等多种疾病模型中起重要作用[6]。Apocynin为加拿大麻素或夹竹桃麻素，是一种典型的NADPH氧化酶抑制剂，相关研究证明Apocynin可降低急性缺血再灌注肾组织氧化应激水平，抑制炎症反应，减轻肾功能损伤程度[7]，同时Apocynin可显著改善1型糖尿病小鼠心脏功能以及抑制慢性心力衰竭兔的心肌纤维化[8]，但对心肌纤维化小鼠的影响未见报道。

心肌纤维化是心肌重塑的重要表现之一，心室重构主要包括胞外信号刺激、胞内信号转导及核内基因转录的活化三个环节，而这些过程均与TGF-β/Smads信号通路密切相关。研究表明，TGF-β1基因缺陷时，心肌纤维化合成发生障碍，抑制了心室重构，继而延缓了心衰的发生和发展[9]。因此，本研究初步研究NADPH氧化酶抑制剂Apocynin对脂多糖心肌纤维化小鼠以及心肌组织中胶原相关因子 ColⅠa1、ColⅢa1的影响，并进一步探讨Apocynin是否通过TGF-β1/Smads信号通路干预了心肌纤维化小鼠纤维化病理进程，以期进一步阐释Apocynin的具体作用机制，并为临床心肌纤维化的治疗提供新的路径。

1 资料和方法

1.1 药品与试剂脂多糖以及Apocynin购自美国Sigma Aldrich公司；TGF-β1、Smad2/3、Smad7兔多克隆抗体以及山羊抗人、兔抗人ColⅠa1、ColⅢa1多克隆抗体及β-actin购自美国Cayman Chemical公司，PV-6000免疫组化试剂盒及DAB显色液均购自北京中杉生物技术有限公司。辣根酶标记山羊抗兔IgG（生产批号：ZB-2303）购自北京中杉金桥公司。

1.2 实验仪器DAB显色试剂购自福建迈新公司产品。蛋白定量试剂盒购自中国碧云天公司。Shan-don325型石蜡切片机购自英国Shandon公司；Genios多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司；BIO-RAD电泳、转膜系统购自美国BIO-RAD公司；DU730紫外可见分光光度计购自美国Beckman公司；PM-10AD倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；ChemiDoc TM XRS+凝胶成像仪器购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验动物健康C57BL/6雄性小鼠40只，体重25～30 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号: 201611179。动物许可证号：SCXK（京）2016-1-003，动物批次号：201707013。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及脂多糖心肌纤维化小鼠模型的制备将40只C57BL/6雄性小鼠适应性喂养一周后，随机分成正常对照组、Apocynin对照组、MF模型组和Apocynin干预组（n=10）。MF模型组：连续4周，每周一次腹腔注射LPS（10 mg/kg，稀释至0.5 ml）；正常对照组: 腹腔注射同模型组等体积生理盐水（0.5 ml）；Apocynin对照组：每周一次腹腔注射Apocynin 10 mg/kg，连续4周；Apocynin干预组：LPS处理小鼠前0.5 h每周一次腹腔注射Apocynin 10 mg/kg，连续4周，LPS给药同MF模型组[10]。

1.4.2 小鼠心肌组织天狼星红染色以上各组小鼠于第四周周末颈椎脱臼处死，随即取出心脏，将左心室心肌组织于4%多聚甲醛中固定24 h，充分水洗后取出，脱水并石蜡包埋，将各组小鼠左心室心肌组织切成4 μm薄片，置于经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上，烤片后备用。随后石蜡切片按照苦味酸-天狼星红胶原染色法染色，采用尼康显微镜照相系统拍照，利用Image-ProPlus 6.0图像分析软件分析，测量心肌切片的胶原容积分数（CVF=心肌胶原面积/所测视野面积）[11]。

1.4.3 小鼠心肌组织中TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3蛋白的表达采用免疫组织化学法检测各组小鼠心肌组织中TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3蛋白相对表达量[12]。SP法检测心肌组织中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白的表达，将含有明显棕黄色或褐色区域的细胞作为阳性细胞。使用荧光倒置显微镜观察每张切片的染色情况，并于高倍镜下（×400）随机选取5个不连续的视野并用Nikon Digital camera进行摄片，并保存图片。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对每张切片选取的视野图片的阳性区域进行光密度（OD）值测定，计算出每张切片平均OD值，并将该值作为整张切片免疫组化染色阳性表达的定量结果。

1.4.4 小鼠心肌组织中心肌纤维化相关因子的表达采用蛋白印记法检测小鼠心肌组织中ColⅠa1、ColⅢa1蛋白的表达[13]。准确称取以上各组小鼠的心肌组织100 mg，在冰块上剪碎后迅速移入组织破碎仪中，并加入400 μl 4℃预冷的总蛋白提取液，随后转入1.5 ml EP管中冰浴30 min，并于4℃，10 000 r/min离心机中离心10 min，随后取上清，参照试剂盒说明用Bradford方法测定总蛋白浓度，并统一调整蛋白浓度为5μg/ml。随后抽取以上各组大鼠20 μl蛋白变性后上样，于质量分数为12%的十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳后，电转至硝酸纤维膜，随后加入山羊抗人、兔抗人ColⅠa1、ColⅢa1多克隆抗体及β-actin一抗、辣根过氧化物酶标志鼠抗兔二抗，化学底物发光法显色，图像扫描分析。显影的条带采用Image-QuaNT软件测量其光密度，以各β-actin为内参，计算各组蛋白相对光密度值。

1.5 统计学处理采用SPSS 21.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用one-way ANOVA检验，两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Apocynin对小鼠心肌组织纤维化的影响各组小鼠心肌组织纤维化病理结果表明（图1），天狼星红染色使小鼠心肌间质内胶原纤维呈红色，其余心肌组织呈黄色，其中模型组明显呈现出较多的胶原纤维。结果显示，Apocynin对照组较正常对照组胶原面积分数无显著的统计学差异（P＞0.05）；MF模型组较正常对照组胶原面积分数升高（P＜0.01）；Apocynin干预组较MF模型组胶原面积分数降低（P＜0.01）（表1）。以上结果表明，脂多糖显著诱导了小鼠的心肌纤维化，Apocynin的干预改善了脂多糖心肌纤维化小鼠心肌纤维化程度。

2.2 Apocynin对小鼠心肌组织中TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3蛋白表达的影响各组小鼠心肌组织中TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3蛋白表达免疫组化结果表明（图2），正常组以及Apocynin对照组小鼠心肌组织中仅极少量阳性黄染颗粒，也就是TGF-β1、Smad2/3及p-Smad2/3在以上两组小鼠心肌组织中几乎无表达或表达量极少；而MF模型组小鼠心肌组织中可见明显纤维蛋白沉积以及明显的黄棕色/褐色阳性染色颗粒，也就是TGF-β1、Smad2/3及p-Smad2/3在MF模型组小鼠心肌组织中有较多的表达；Apocynin干预组小鼠心肌组织中可见较少的黄棕色/褐色阳性染色颗粒，但是阳性染色颗粒较MF模型组小鼠少。

图1 各组小鼠心肌组织天狼星红染色及心肌组织胶原面积分数比较图示（×400）

表1 各组小鼠心肌组织胶原面积分数比较（x±s）

统计学结果显示，Apocynin对照组较正常对照组TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；MF模型组较正常对照组TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3蛋白表达升高（P＜0.01）；Apocynin干预组较MF模型组TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3蛋白表达降低（P＜0.01）（表2）。以上结果表明，Apocynin下调了心肌纤维化小鼠TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白的表达，Apocynin通过TGF-β1/Smad信号通路减轻了脂多糖诱导的小鼠心肌纤维化程度。

图2 各组小鼠心肌组织中TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3蛋白免疫组化结果图示（×400，A：正常对照组；B：Apocynin对照组；C：MF模型组；D：Apocynin干预组，n=10）

表2 Apocynin对小鼠心肌组织中TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3蛋白表达的影响（x±s）

2.3 Apocynin对小鼠心肌纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1表达的影响各组小鼠心肌纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1 Western blot表达结果如图3～4所示。正常组以及Apocynin对照组小鼠心肌组织中仅有少量纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1表达；而MF模型组小鼠心肌组织中可见纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1表达量显著增加。统计学结果表明，Apocynin对照组较正常对照组纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1蛋白表达无显著的统计学差异（P＞0.05）；MF模型组较正常对照组ColⅠa1、ColⅢa1蛋白表达显著升高（P＜0.01）；Apocynin干预组较MF模型组纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1蛋白表达显著降低（P＜0.01）（图3～4）。以上结果表明，Apocynin显著下调了心肌纤维化小鼠纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1蛋白的表达，Apocynin通过TGF-β1/Smad信号通路介导纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1蛋白的下调，从而减轻了脂多糖诱导的小鼠心肌纤维化。

图3 Apocynin对各组小鼠心肌纤维化因子ColⅠa1表达影响的比较

图4 Apocynin对各组小鼠心肌纤维化因子ColⅢa1表达影响的比较

3 讨论

心肌纤维化是以心脏间质成纤维细胞过度增殖、胶原过度沉积及异常分布为特征的心脏间质重构，近年来大量研究表明，心肌纤维化与许多心脏疾病有密切关系其与多种心血管疾病密切相关[14]。由于细胞外基质（ECM）积聚，纤维化降低了心肌壁顺应性，导致收缩和舒张功能受损并引起心律失常[15]。虽然一些常规药物如β-受体阻滞剂和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）抑制剂在临床试验中已显示缓解心脏纤维化，但这些传统疗法并不倾向于靶向作用于纤维化的相关分子，并且对心力衰竭患者心脏纤维化的进展无显著作用。

多种信号分子涉及心脏纤维化的进程，进一步研究相关分子信号的识别将有助于我们有效地靶向作用于心肌纤维以延缓心脏纤维化。其中氧化应激诱导的炎症信号可激活肌成纤维细胞，它在局部和弥漫性纤维化中起重要作用[16]。临床和实验研究表明，在心肌重塑过程中，明显存在过度ROS产生，严重与抗氧化剂防御不平衡[17]。此外，产生的ROS可激活广泛的肥大信号激酶和转录因子从而调节心肌细胞凋亡；与此同时ROS还可增强纤维细胞增殖并刺激基质金属蛋白酶（MMP），导致心脏纤维化[18]。在心脏组织中，ROS主要来源于膜结合酶复合物NADPH氧化酶（NOX）。研究证明，在心肌纤维化患者心肌中，NOX的表达显著增强[19]，同时在动物实验证明，AngⅡ诱导的心脏肥大在NOX基因缺陷型的小鼠中减弱，并且NOX增强了由大鼠TGF-β，AngⅡ刺激的心肌纤维化[20]。因此，针对性应用NADPH氧化酶抑制剂可能会改善心肌纤维化的发生，本研究证明，Apocynin的干预显著改善了脂多糖心肌纤维化小鼠心肌纤维化程度，并且显著下调了心肌纤维化小鼠纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1蛋白的表达，此研究结果与此前相关报道一致，但对其具体作用机制无相关报道。

哺乳动物成纤维细胞可分泌三种同型TGF-β（1、2和3），并可被耦连蛋白介导的ECM收缩牵涉的模式被蛋白水解活化，其中Ⅰ型TGF-β受体也称为活化素受体样激酶（ALK）5，主要参与TGF-β的纤维化活性[21]。参与ALK5激活的TGF-β1可使Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3与Smad4结合并转位进入细胞核，最终诱导激活纤维化基因[22]。研究表明，使用ALK抑制剂SM16钝化TGF-β诱导的胶原Iα2和体外赖氨酰氧化酶表达，可抑制TGF-β1在心脏重构中的有害作用，从而减轻心脏纤维化[23]。因此作用于TGF-β1/Smad信号通路可能是抗纤维化治疗的一个可行选择。本研究结果显示，脂多糖诱导的心肌纤维化模型显著上调了TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白的表达；同时Apocynin的干预显著下调了心肌纤维化小鼠TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白的表达。因此Apocynin通过TGF-β1/Smad信号通路减轻了脂多糖诱导的小鼠心肌纤维化程度。

综上所述，NOX介导的氧化应激在心肌纤维化进展中起重要作用；阻断心肌TGF-β信号传导途径可有效减轻心脏纤维化。NOX氧化酶抑制剂Apocynin通过TGF-β1/Smad信号通路介导了纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1蛋白的下调，从而减轻了脂多糖诱导的小鼠心肌纤维化。