高效液相色谱-质谱联用法HPLC-MS/MS测定CRRT时血浆哌拉西林/他唑巴坦浓度

蔡云 徐丽

[摘要] 目的 建立准确、灵敏的高效液相色谱-质谱联用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）测定持续肾脏替代（continuous renal replacement， CRRT）时人血浆中哌拉西林钠/他唑巴坦钠的浓度。 方法 选用高、低两种剂量给药，采取单制剂双周期序贯试验设计，对12例行CRRT患者完成哌拉西林/他唑巴坦钠静脉滴注之后，使用HPLC-MS/MS方法同时测定哌拉西林及他唑巴坦的浓度。采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱;流动相为甲醇：乙腈：水：1 mol/L 氨水：甲酸（25∶15∶60∶0.1∶0.05），质谱检测采用电喷雾离子源，多反应离子监测（MRM）模式检测。 结果 血浆中哌拉西林线性范围为1～100 mg/L，他唑巴坦线性范围为0.5～40.0 mg/L，高、中、低3个浓度日内及日间精密度均小于5%。实测12例行CRRT患者，血药浓度与给药剂量呈相关性。 结论 高效液相色谱-质谱联用法灵敏度高、特异性好，可以运用于脓毒症患者接受CRRT时血浆哌拉西林/他唑巴坦浓度的测定。

[关键词] 哌拉西林钠/他唑巴坦钠;持续肾脏替代治疗;高效液相色谱-质谱联用法;药动学

[中图分类号] R969          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）05-0037-05

[Abstract] Objective To establish an accurate and sensitive high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS/MS） for the determination of piperacillin in human plasma the concentration of sodium/tazobactam sodium during continuous renal replacement（CRRT）. Methods The high-dose and low-dose two-dose method were used to design a single-dose two-cycle sequential test. After 12 patients with CRRT were treated with piperacillin/tazobactam sodium intravenously， HPLC-MS/MS was used simultaneously to determine the concentrations of piperacillin and tazobactam. The Gemini C18（50 mm×3.0 mm， 3 μm） analytical column was used. The mobile phase was methanol， acetonitrile， water， 1 mol/L ammonia， formic acid（25：15：60：0.1：0.05）. Mass spectrometry was detected using an electrospray ion source and multiple reactive ion monitoring（MRM） mode. Results The linear range of piperacillin in plasma was 1-100 mg/L， and the linear range of tazobactam was 0.5～40.0 mg/L. The intra-day and inter-day precision of high， medium and low concentrations were less than 5%. The blood concentration of 12 patients who underwent CRRT was correlated with the dose. Conclusion High performance liquid chromatography-mass spectrometry has high sensitivity and specificity， and can be used to determine the plasma concentration of piperacillin/tazobactam in patients with sepsis receiving CRRT.

[Key words] Piperacillin sodium/tazobactam sodium; Continuous renal replacement therapy; High performance liquid chromatography-mass spectrometry（HPLC-MS/MS）; Pharmacokinetics

哌拉西林/他唑巴坦屬于β-内酰胺/内酰胺酶抑制剂复合制剂，对于许多革兰阳性和革兰阴性的需氧菌及厌氧菌具有抗菌活性，临床广泛应用于肺部、皮肤软组织、腹腔、泌尿道等感染的脓毒症患者[1]。但当患者进行CRRT时使用哌拉西林/他唑巴坦，其药代动力学可能会受到较大影响[2]。在CRRT过程中进行哌拉西林他唑巴坦的血药浓度监测可以帮助临床医生选择更加合理的给药方式。目前国内大多采用高效液相色谱法测定生物标本中哌拉西林及他唑巴坦的浓度，耗时长、检测限高;本研究旨在构建一种更高效、准确地测定哌拉西林、他唑巴坦浓度的高效液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）方法，为该药物在CRRT时的药代动力学研究提供理论支撑，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

PRISMA连续性血液净化仪，Prisma M100 Pre Set管路及滤器，Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱（上海科晓科学仪器有限公司）;哌拉西林钠/他唑巴坦钠[1.25 g（4∶1）/支，批号：0512461，华北制药集团有限责任公司生产]。哌拉西林标准品100 mg（中国食品药品检定研究院，批号：130419-201205），他唑巴坦标准品（中国食品药品检定研究院，批号：130511-201303），乙腈（色谱纯）（美国天地有限公司）、磷酸二氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）及甲醇（色谱纯，美国天地有限公司）。

1.2方法

采用PRISMA连续性血液净化仪，滤器采用配套的Prisma M100 Pre Set管路及滤器（面积0.9 m2，AN69HF空心纤维），置换液前稀释法输入;模式统一采用持续静脉-静脉血液滤过（continuous veno venous hemofiltration，CVVH），置换液流速2000 mL/h，血流速120～150 mL/min。精密称取哌拉西林标准品95 mg，采用浓度45%甲醇将其溶解，而后将其定容，配置成相应储备液，即10 g/L;精密称取他唑巴坦标准品25 mg，方法同上，配置成1 g/L储备液。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱;流动相为甲醇∶乙腈∶水∶1 mol/L 氨水：甲酸（25∶15∶60∶0.1∶0.05），流速为0.23 mL/min，柱温为40℃。质谱检测采用电喷雾离子源，多反应离子监测模式检测，喷雾电压为5000 V，干燥气流速为7 L/min，温度为450℃，碰撞气为7 psi，雾化气为8 psi，气帘气为7 psi;离子去簇电压20 V;环形聚焦电压57 V;SHA、M2（两种特用符号）和内标d5-SHA 监测离子对m/z分别为265.2/232.2、194.1/176.1和 270.3/237.3，碰撞室射出电压分别为5、9和5 V，碰撞诱导解离电压分别为17、16和18 V，入口电压分别为7、5和7 V。

2.2 血浆样品处理

（1）处理哌拉西林钠血浆样品。将血浆样品0.24 mL加入Eppendorf管（錐形带盖塑料管）内（1.5 mL），而后加入水10 μL，另加入甲醇0.70 mL，将其均匀摇晃之后（1 min），以10000 r/min的速率进行离心，时间控制在4 min，将清液取出（10 μL），以此分析HPLC。（2）他唑巴坦钠血浆样品处理。于锥形带盖塑料管内（1.5 mL），加入血浆样品0.24 mL，而后加入水10 μL，然后加入乙腈0.24 mL，将其均匀摇晃之后（1 min），采用10000 r/min离心，时间控制在1 min，将清液取出（20 μL），以此作为HPLC实施分析。

2.3 血浆中他唑巴坦钠及哌拉西林钠相应标准工作曲线制备

（1）哌拉西林钠。将若干份空白血浆取出，0.25 mL/份，将浓度各异的哌拉西林溶液（10 μL）分别加入，配置6个血浆样品，其质量浓度分别为200、100、50、25、5和1 mg/L，依据上文血浆样品的处理操作，记录色谱图，横坐标表示样品浓度，纵坐标表示色谱峰面积值，便可得出加权回归方程，即为r=0.9946，Y=-2846+23458.57X;其质量浓度区间为1～190 mg/L（S/N>10）。（2）他唑巴坦钠。将若干份空白血浆取出，0.25 mL/份，将浓度各异的他唑巴坦溶液（10 μL）分别加入，配置6个血浆样品，其质量浓度分别为40、20、10、5、2.5和0.5 mg/L，将色谱图予以记录，横坐标表示样品浓度，纵坐标表示色谱峰面积值，便可得出加权回归方程，即为r=0.9942，Y=-8611+13498.5X;其质量浓度区间为0.5～40.0 mg/L（S/N>10）。

2.4样品绝对回收率试验

（1）哌拉西林钠。先取0.25 mL空白血浆，依据2.3操作流程配置3个浓度的标准血样，即为高、中、低，各浓度均为5份，依据2.2相应处理流程，对色谱图予以记录。此外，取上述3个浓度的相应标准样，不对其给予处理，采用流动相，将其容积设定为相同体积，实施进样处理，并对其色谱图予以记录[3]。通过峰面积比，对绝对回收率进行计算，计算公式：回收率（%）=（加标样品测定值-样品测定值×加标样品中测定液体的比例）/加标量×100%。最终结果可知，2.5 mg/L质量浓度回收率为（80.1±5.2）%，RSD为6.6%;50.0 mg/L为（89.0±1.9）%，RSD为2.1%;160.0 mg/L为（87.1±1.1）%，其RSD为1.3%。（2）他唑巴坦钠。操作方法同上，最终结果可知，1.0 mg/L质量浓度回收率为（83.8±1.5）%，RSD为1.8%;10.0 mg/L为（86.0±2.3）%，RSD为2.6%;30.0 mg/L为（94.1±1.5）%，其RSD为1.6%。

2.5 方法的准确度与精密度

（1）哌拉西林钠。先取0.25 mL空白血浆，依据2.3操作流程配置3个浓度的标准血样，即为高、中、低，各浓度均为5份，依据2.2相应处理流程，对样品峰面积比值及面积予以记录，将其代至同条工作曲线，将浓度算出，并将其当作相应精密度指标;最终的相对回收率=计算所得出的浓度/加入浓度[4-7]。最终结果表明，2.5 mg/L浓度的标准血浆日内RSD为1.1%，日间RSD为2.0%，平均回收率为（99.4±1.4）%;50.0 mg/L为3.9%，日间RSD为3.3%，平均回收率为（99.7±2.9）%;160.0 mg/L为2.7%，日间RSD为2.4%，平均回收率为（105.5±3.0）%。（2）他唑巴坦钠。操作流程同上，最终结果可知，1.0 mg/L浓度的标准血浆日内RSD为1.6%，日间RSD为2.7%，平均回收率为（99.0±2.0）%;10.0 mg/L1为2.6%，日间RSD为2.1%，平均回收率为（99.6±2.2）%;30.0 mg/L为1.6%，日间RSD为3.0%，平均回收率为（100.3±1.5）%。

2.6 血浆样品冻融稳定性

先取0.25 mL空白血浆，依据2.3操作流程配置3个浓度的标准血样，即为高、中、低，将其放置于温度为-20℃的环境中，保存时间为3～5 d，然后将其取出，依据2.2相关操作实施处理，经哌拉西林钠浓度予以测定;另外，对其中三份样本实施反复的冻融操作，次数不少于3次，而后将其哌拉西林钠浓度给予再次测定。最终结果可知，在温度为-20 ℃环境中所保存的血浆，在保存的3 d时间内，哌拉西林钠浓度在下降幅度方面均小于10%，而在6 d之内，其存在有大于10%的变化趋势。至此可知，在实施分次采集血样操作过程中，需在4 d之内将其完成测定工作，并将其放置于相位室温环境中，其在3 h内在变化方面不会大于10%，而若超过6 h，则其下降就会大于15%，所以，需在3 h内完成样品的测定处理工作，将其放置冻融环境中，具有良好的稳定性。（2）他唑巴坦钠。方法同上，完成2.2项操作之后，对他唑巴坦钠浓度进行测定;另外，对其中三份样本实施反复的冻融操作，次数不少于3次，而后将其他唑巴坦钠浓度给予再次测定。最终结果可知，在温度为-20℃环境中所保存的血浆，在保存的3 d时间内，他唑巴坦钠浓度在下降幅度方面均小于10%，而在5 d之内，其存在有大于10%的变化趋势。至此可知，在实施分次采集血样操作过程中，需在3 d之内将其完成测定工作，当完成他唑巴坦钠血浆样品通过蛋白沉淀处理操作之后，所得到的溶液放置室温中，其在3 h内在变化方面不会大于10%，而若超过7 h，则其下降会>15%，所以，需在3 h内完成样品的测定处理工作。

2.7 患者标准

接受CRRT的患者，同时符合：（1）年龄：18～70岁;（2）无青霉素过敏史且青霉素皮试阴性;（3）既往无慢性肝、肾功能不全病史;（4）行CRRT前1周内未使用过含哌拉西林及他唑巴坦成分的药物;（5）临床判断单用或联用哌拉西林/他唑巴坦可以有效覆盖可能致病菌;（6）本人或授权人书面同意接受本研究。

2.8 哌拉西林钠他唑巴坦钠人体药动学

（1）哌拉西林钠。单次试验1：选取12例符合入选标准的患者，对试剂实施静脉滴注，即哌拉西林/他唑巴坦（1 g/0.25 g）/次，采用生理盐水100 mL溶解，对滴速予以严格控制，恒速运行，滴注时间为30 min。各受试者于实施静脉滴注前，以及开始滴注之后5、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min分別抽取5 mL外周静脉血。血样经10 min、3000 r/min离心后取上清液2 mL，-80℃保存，等待检测。单次试验2：所选取12例严重脓毒症受试者在单次实验1以后48 h后，再次对试剂实施静脉滴注，即哌拉西林/他唑巴坦（2 g/0.5 g）/次，方法同上。

2.9 方法的专属性

（1）哌拉西林钠。选取6例严重脓毒症受试者，取其0.25 mL空白血浆;依据2.2项相关操作，实施15 μL进样，对色谱图予以记录;在空白血浆中，将哌拉西林钠溶液放置其中依据相同方法，便可得出色谱图，保存时间控制在5 min;当患者完成给药滴注之后，取其血浆样品，依据上述操作，得出色谱图;然后对比各色谱图，见图1（A、B、C）所示。（2）他唑巴坦钠。另取6例严重脓毒症受试者，取其0.25 mL空白血浆;依据2.2项相关操作，实施15 μL进样，对色谱图予以记录;在空白血浆中，将他唑巴坦钠溶液放置其中依据相同方法，便可得出色谱图，保留时间8 min;当患者完成给药滴注之后，取其血浆样品，依据上述操作，得出色谱图;然后对比各色谱图，图1（D、E、F）所示。

2.10制剂给药药动学

所选取的12例严重脓毒症受试者，当其完成哌拉西林钠他唑巴钠30 min静脉滴注后，其药动学参数，见表1。

表1   哌拉西林钠他唑巴钠静滴的药动学参数

结果可知，哌拉西林钠（1.0 g）完成30 min静滴之后，其与哌拉西林钠（2.0 g）完成静滴之后的计量比为50.0%，二者之间的AUC0～6比为47%，Cmax为49%，在计量方面呈现相关性。而在完成静脉滴注剂量为他唑巴坦钠（0.50 g）与他唑巴坦钠（0.25 g）的比值则为50%，二者之间的AUC0～6比为44%，Cmax为47%，在计量方面呈现相关性。

3讨论

本次试验研究构建的基于血浆的HPLC-MS/MS测定法，患者血浆当中的杂质，对样品峰不造成干扰，基于此种试验环境下，其具有较好的重复性，特异性也较好，具有较高的灵敏度、精密度及回收率，在质量控制方面也与相关要求相符，与生物样品具体的分析要求也相符[8-12]。

国外研究表明，CRRT时几乎所有抗菌药物的药代动力学都会发生改变，影响程度可能取决于药物的分子量、分布容积、蛋白结合率、滤器的材质、CRRT模式等等多种因素[13-20]。国内范珠[11]对健康志愿者的研究显示静滴哌拉西林/他唑巴坦（2 g/0.5 g）后Cmax分别为（152.7±23.8）mg/L和（32.8±5.8）mg/L，t1/2分别为（1.3±0.5）h和（0.95±0.18）h，与本研究实测结果有较大差异，初步证实了CRRT确实会对哌拉西林他唑巴坦的药代学造成较大影响。本研究构建的HPLC-MS/MS方法可以准确、灵敏地检测CRRT时哌拉西林他唑巴坦的血药浓度，为临床对接受CRRT的脓毒症患者制定更加合理的给药方案提供了一项切实可行的手段，有助于发挥哌拉西林/他唑巴坦的最大疗效、改善患者的预后。

[参考文献]

[1] 陈新谦，金有豫，汤光. 新编药物学（第17版）[M]. 北京：人民卫生出版社，2011：65.

[2] Valtonen M，Tiula E，Takkunen O，et al. Elimination of the Piperacillin/Tazobactam combination during continuous venovenous haemofiltration and haemodiafiltration in patients with acute renal failure[J]. J Antimicrob Chemother，2001，48（6）：881-885.

[3] 陳怀生，王薇，温隽珉，等. 亚胺培南/西司他丁与哌拉西林/他唑巴坦治疗30例脓毒症患者疗效比较[J]. 临床合理用药杂志，2011，4（36）：17-19.

[4] 许伟石，邓诗琳，韩春茂，等. 哌拉西林/他唑巴坦防治烧伤感染的多中心临床试验[J]. 中华烧伤杂志，2002， 18（2）：75-77.

[5] 向松涛，王树声，甘澍，等. 经皮肾镜取石术后尿脓毒症休克的诊治特点分析[J]. 中华泌尿外科杂志，2010， 31（8）：520-523.

[6] 任敏蒲，刘岚，李丽，等. 儿童肺炎克雷伯菌脓毒症临床特点及细菌耐药性分析[J]. 中国抗生素杂志，2013， 38（4）：280-284.

[7] 卢中秋，邱巧檬. 创伤弧菌脓毒症治疗的研究现状[J]. 世界急危重病医学杂志，2004，20（3）：226-229.

[8] 陈科. 哌拉西林钠他唑巴坦用于重症脓毒症感染治疗效果探讨[J]. 中国医学工程，2014，16（8）：88-89.

[9] T Nakada，S Oda，K Matsuda，et al. Continuous hemodiafiltration with PMMA hemofilter in treatment of patients with septic shock[J]. Mol Med，2008，14（5-6）：257-263.

[10] Vincent JL.Adjustment of antimicrobial regimen in critically ill patients undergoing continuous renal replacement therapy[M].Yearbook of Intensive Care And Emergency Medicine. Berlin：Springer，2007：592-608.

[11] 范珠. 哌拉西林他唑巴坦人体药动学研究[J]. 中国药业，2016，25（9）：5-8.

[12] Lind PM，Salihovic S，Stubleski J，et al. Changes in plasma levels of perfluoroalkyl substances（PFASs）are related to increase in carotid intima-media thickness over 10 years-a longitudinal study[J]. Environ Health，2018，17（1）：59.

[13] Stamm RA，Fazili Z，Pfeiffer CM. Addition of Exogenous γ-Glutamyl Hydrolase Eliminates the Need for Lengthy Incubation of Whole-Blood Lysate for Quantitation of Folate Vitamers by High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J]. Curr Dev Nutr，2017，2（1）：1-9.

[14] Hao JY，Wan Y，Yao XH，et al. Effect of different planting areas on the chemical compositions and hypoglycemic and antioxidant activities of mulberry leaf extracts in Southern China[J]. PLoS One. 2018，13（6）：e0198072.

[15] Novotna B，Abdel-Hamid M，Koblizek V，et al. A pilot data analysis of a metabolomic HPLC-MS/MS study of patients with COPD[J]. Adv Clin Exp Med，2018，27（4）：531-539.

[16] Wang Z，Olenyuk BZ，Shih JC，et al. Quantification and pharmacokinetic study of tumor-targeting agent MHI148-clorgyline amide in mouse plasma using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. J Pharm Anal，2018，8（3）：153-159.

[17] Sobeh M，Mahmoud MF，Hasan RA，et al. Tannin-rich extracts from Lannea stuhlmannii and Lannea humilis（Anacardiaceae）exhibit hepatoprotective activities in vivo via enhancement of the anti-apoptotic protein Bcl-2[J].Sci Rep，2018，8（1）：9343.

[18] Chirollo C，Vassallo A，Dal Piaz F，et al. Investigation of the Persistence of Penicillin G and Dihydrostreptomycin Residues in Milk of Lactating Buffaloes （Bubalus bubalis）Using Ultra-High-Performance Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry[J]. J Agric Food Chem，2018，66（25）：6388-6393.

[19] Boonya-Atichart A，Boontanon SK，Boontanon N. Study of hybrid membrane filtration and photocatalysis for removal of perfluorooctanoic acid（PFOA） in groundwater[J].Water Sci Technol，2018，2017（2）：561-569.

[20] Hongkachok C，Boontanon SK，Boontanon N，et al. Levels of perfluorinated compounds（PFCs） in groundwater around improper municipal and industrial waste disposal sites in Thailand and health risk assessment[J].Water Sci Technol，2018，2017（2）：457-466.

（收稿日期：2018-06-27）