杭白菊提取液对小鼠肝纤维化的保护作用及机制研究

梁育汝，王彩冰，陈由阳，罗红叶，屠兴荣，唐 敏

(右江民族医学院：1.临床医学院；2.应用生理研究室，广西百色 533000)

杭白菊[Dendranthema mori-folium(Ramat)Tzvel，DM]为菊科植物菊的干燥头状花序，是常用的中草药及生活饮品，其性味甘、苦、微寒，归肺、肝经，其主要成分有挥发油、氨基酸、类黄酮及维生素B等，具有散风清热、平肝明目、清热解毒之功效[1]。近年的研究[2-7]发现，杭白菊有减慢心率、保肝护心、抑菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤、防衰老等功能。杭白菊在肝纤维化方面的干预少有文献报道，为此本实验应用四氯化碳(CCl4)建立小鼠肝纤维化模型[8]，采用不同浓度杭白菊提取液给小鼠灌胃，检测肝组织和血清的生化指标和肝组织病理切片，并与临床用于治疗肝病药物水飞蓟宾(用量换算成小鼠用量[9-10])作比较，探讨杭白菊对肝纤维化的干预作用及作用机制，为杭白菊的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级5周龄左右的健康KM小鼠72只，体质重(25±2)g，雌雄各半，由右江民族医学院动物实验中心提供(实验动物生产许可证：SCXK桂2017-0003；实验动物使用许可证：SCXK桂2017-0004)，分笼饲养，室温25 ℃左右，自由进食和进水。

1.2药品、试剂及器械 杭白菊(康美药业股份有限公司，批号170550751)；CCl4(成都市科龙化工试剂厂，批号20130329)；水飞蓟宾胶囊(天津天士力省特制药有限公司，批号H20040299)；0.9% NaCl注射液(广西裕源药业有限公司，批号L16062904)；甲醛(烟台市双双化工有限公司，批号20170701)。丙氨酸氨基转移酶(ALT)酶联免疫试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)酶联免疫试剂盒、透明质酸(HA)酶联免疫检测试剂盒、白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)酶联免疫试剂盒、丙二醛(MDA)酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为20180105、20180105、20180106、20180106、20180103、20180104)。多功能酶标仪(上壹桥国际贸易有限公司，型号Tristar Lb941)；数码显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司，型号BA2100igital)；离心机(上海安亭科学仪器厂，型号安亭 TGL-16G)；电子天平(诸暨市超泽衡器设备有限公司，型号JM-B1003)；三用恒温水箱(金坛市医疗仪器厂，型号HH-W600)。

1.3杭白菊提取液的制备 取杭白菊干品300 g，用2 000 mL 30 ℃蒸馏水浸泡30 min，文火煮沸2 h，过滤液文火隔水浓缩至500 mL(相当于生药600 mg/mL)，冷却后放入4 ℃冰箱保存备用，用时以双蒸水配成所需浓度的杭白菊提取液。

1.4动物分组与给药方法 动物适应性饲养1周，分为6组。正常对照组和模型对照组灌胃0.9% NaCl注射液，水飞蓟宾组灌胃5.5 mg/mL水飞蓟宾，杭白菊低、中、高浓度组分别灌胃杭白菊提取液150、300、600 mg/mL；除正常对照组为0.9% NaCl注射液外，其余均为0.1% CCl4；灌胃和腹腔注射用量均按10 mL/kg。各组小鼠先每天灌胃1次连续1周，接着每天1次的灌胃和腹腔注射隔日交替进行4周，再每天灌胃1次连续1周。末次用药灌胃前禁食12 h、禁水2 h，在末次用药灌胃后进行相应指标检测。

1.5动物标本的制备及肝指数检测 末次灌胃30 min后以摘除眼球法采血离心分离血清；迅速剖腹取肝放至电子天平记录肝湿质量(肝指数=肝湿质量/体质量×100%)，取肝右叶浸泡于10%甲醛溶液固定30 min后，脱水、石蜡包埋、苏木素-伊红(HE)染色制成组织切片，通过数码显微镜检查各组小鼠肝脏的组织结构并摄像。1.6小鼠血清ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA水平的检测 取血清，分别用ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA酶联免疫检测试剂盒，通过酶标仪按说明书要求进行操作检测。

2 结 果

2.1各组小鼠血清ALT、AST水平和肝指数的结果比较 模型对照组和杭白菊低、中、高浓度组的血清ALT、AST水平均明显高于正常对照组和水飞蓟宾组(P<0.01，P<0.05)；水飞蓟宾组的血清ALT和AST均与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。杭白菊低、中、高浓度组的血清ALT组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)；杭白菊中浓度组的血清AST水平明显低于杭白菊低和高浓度组(P<0.01)，杭白菊低、高浓度的血清AST水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型对照组、水飞蓟宾组和杭白菊低、中、高浓度组的肝指数之间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)，但均明显低于正常对照组(P<0.01，0.05)。见表1。

2.2各组小鼠血清HA、IL-6、SOD、MDA水平比较 模型对照组和杭白菊低、中浓度组的血清HA水平明显高于正常对照组(P<0.01)，杭白菊高浓度组和水飞蓟宾组的血清HA水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，水飞蓟宾组和杭白菊低、中、高浓度组的血清HA水平明显低于模型对照组(P<0.01)，杭白菊低、中浓度组的血清HA水平明显高于水飞蓟宾组(P<0.01，P<0.05)，杭白菊高浓度组与水飞蓟宾组的血清HA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，杭白菊中、高浓度组的血清HA水平明显低于杭白菊低浓度组(P<0.01，P<0.05)，杭白菊中、高浓度组的血清HA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型对照组的血清IL-6水平明显高于正常对照组和水飞蓟宾组(P<0.01，P<0.05)，其余各组的血清IL-6水平组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。除水飞蓟宾组和杭白菊低、高浓度组的血清SOD水平明显高于模型对照组(P<0.01)和杭白菊高浓度组的血清SOD活性明显高于正常对照组(P<0.05)之外，其余各组的血清SOD活性组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。模型对照组的血清MDA水平明显高于其余各组(P<0.01)，水飞蓟宾组的血清MDA水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，杭白菊低、中、高浓度组的血清MDA水平明显高于正常对照组和水飞蓟宾组(P<0.01)，杭白菊高浓度组的血清MDA水平明显低于杭白菊低、中浓度组(P<0.01，P<0.05)。见表2。

表1 杭白菊提取液对小鼠血清的ALT、AST水平及肝指数的影响

a:P<0.05,b:P<0.01，与正常对照组比较；c:P<0.05,d:P<0.01，与模型对照组比较；e：P<0.05,f：P<0.01，与水飞蓟宾组比较；x：P<0.01，与杭白菊低浓度组比较;y:P<0.01，与杭白菊中浓度组比较

2.3肝组织病理切片检查 正常对照组肝细胞结构清晰，肝细胞形态正常，肝索排列规则，中央静脉管壁光滑，无肝细胞变性坏死；模型对照组肝细胞结构模糊，细胞质疏松，细胞核体积变小，肝索排列紊乱甚至消失，中央静脉管腔内堆积大量脱落的坏死肝组织结构，肝细胞变性坏死区域明显由结缔组织代之，以中央静脉管周边更为明显；水飞蓟宾组、杭白菊低浓度组和杭白菊中浓度组与模型对照组相比较，前三者的肝细胞结构较为清晰，肝细胞变性坏死数量和区域等均有较大的改善，但中央静脉管腔内仍见少量的脱落肝组织结构；杭白菊高浓度组明显与正常对照组相接近。见图1。

表2 杭白菊提取液对小鼠血清HA、IL-6、SOD、MDA水平的比较

a:P<0.05,b:P<0.01，与正常对照组比较；c:P<0.05,d:P<0.01，与模型对照组比较；e：P<0.05,f：P<0.01，与水飞蓟宾组比较；x：P<0.05,y：P<0.01，与杭白菊低浓度组比较;m:P<0.05，与杭白菊中浓度组比较

A:正常对照组;B:模型对照组;C:水飞蓟宾组;D:杭白菊低浓度组;E:杭白菊中浓度组；F:杭白菊高浓度组

图1 各组小鼠肝组织切片(×400)

3 讨 论

CCl4进入机体经血液循环到达肝脏生成自由基CCl3-和CCl3O23-破坏肝细胞膜结构，使肝细胞膜磷脂发生脂质过氧化而生成脂质过氧化物(LPO)，致使肝细胞损坏；ALT和AST是胞内酶，当肝细胞损坏时会引起血清中的ALT和AST水平升高，血清ALT/AST比值小于1反映肝纤维化，其比值越低则肝纤维化程度越高；SOD是体内主要的抗氧化酶，它通过清除超氧自由基防止细胞膜脂质过氧化，达到保护细胞膜的完整性，当自由基生成过多或清除能力下降都会引起细胞损坏；MDA是LPO的中间代谢产物，测定MDA水平可反映LPO水平[11-15]。

肝脏的炎性反应和中毒损伤均可引起纤维化；肝纤维化的病理基础是肝细胞变性坏死被成纤维细胞取代，而成纤维细胞产生胶原沉积于肝结缔组织，导致肝纤维化并可演变为肝硬化；HA为胶原成分之一，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况，HA与肝纤维化的严重程度呈正相关[12-13,16]。肝细胞变性坏死将激活肝脏库普氏细胞释放多种炎症因子，IL-6是最主要炎症因子之一，IL-6作用于肝脏成纤维细胞产生胶原进一步加重肝细胞损伤和肝纤维化[17-18]。

本研究结果显示：模型对照组的血清ALT/AST比值小于1，HA、IL-6、MDA水平均明显高于正常对照组，而肝指数明显低于正常对照组，肝细胞结构模糊，细胞质疏松，细胞核体积变小，肝索排列紊乱甚至消失，中央静脉管腔内堆积大量脱落的坏死肝组织结构，肝细胞变性坏死区域明显由结缔组织代之；说明本实验应用CCl4成功建立小鼠肝纤维化模型，提示CCl4导致肝纤维化不仅是由于CCl4生成自由基，同时CCl4也引发肝脏的炎性反应，通过这两方面共同破坏肝细胞膜使肝脏内细胞变性坏死和胶原沉积所致。

本研究结果也显示：水飞蓟宾组和杭白菊低、中、高浓度组的血清ALT/AST<1、肝指数下降，前三者的肝细胞结构较模型正常对照组清晰，肝细胞坏死数量和区域等均有较大的改善，但中央静脉管腔内仍见少量的脱落肝组织结构；杭白菊高浓度组的组织结构明显与正常对照组相接近；说明这4组小鼠均发生肝纤维化，4组所用药物均能不同程度地减轻CCl4对肝细胞损伤和肝纤维化。此外，本研究结果还显示：水飞蓟宾组的血清ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA均与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)；而明显低于模型对照组，说明水飞蓟宾组发生的肝纤维化程度较小，提示水飞蓟宾能有效清除CCl4生成的自由基和改善CCl4引起的炎性反应，从而干预CCl4所致的肝纤维化并起到保护肝细胞膜作用。杭白菊低、中、高浓度组的血清ALT、AST和MDA明显高于正常对照组而明显低于模型对照组，血清HA明显低于模型对照组、前两者明显高于正常对照组、后者与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)；杭白菊低、中、高浓度组血清IL-6既与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)，也与模型对照组差异无统计学意义(P>0.05)，杭白菊低浓度组的血清SOD明显高于模型对照组；杭白菊高浓度组的血清SOD明显高于模型对照组和正常对照组，杭白菊中、高浓度组的血清HA明显低于杭白菊低浓度组，杭白菊高浓度组的MDA明显低于杭白菊低、中浓度组；这些说明杭白菊对CCl4所致的肝纤维化有不同程度的改善作用，其既能提高SOD，降低MDA，也能抵制HA生成，虽然血清IL-6与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)，但也与模型对照组差异无统计学意义(P>0.05)，从数值这一角度说杭白菊也在一定程度上抵制CCl4的炎性反应；提示杭白菊可一定程度清除CCl4生成的自由基改善炎性反应，在一定程度上显示有量效关系。从杭白菊高浓度组的组织切片观察，肝细胞结构清晰，肝细胞形态正常，肝索排列规则，中央静脉管壁光滑，无明显的肝细胞变性坏死，其组织切片与正常对照组相接近，组织切片结构表现明显优于其血清生化检测结果反映；提示杭白菊高浓度组对CCl4造成肝纤维化的改善不仅通过消除自由基和抵制炎性反应这两途径起作用，很有可能还存在第三条途径起作用，具体是何途径有待今后的研究和探讨。

综上所述，CCl4在机体通过生成自由基和引发炎性反应这两个方面造成肝纤维化；水飞蓟宾和杭白菊通过消除机体自由基和炎性反应干预肝纤维化；低浓度和中浓度杭白菊对小鼠肝纤维化模型的各项血清生化指标、肝指数和组织病理切片改善程度劣于水飞蓟宾，高浓度杭白菊的各项血清生化指标、肝指数劣于水飞蓟宾但组织病理切片优于水飞蓟宾的改善效果，由此推测杭白菊干预肝纤维化可能还存在其他途径。

肝脏是机体的主要解毒器官，它能对机体的有害物质及微生物抗原性物质进行解毒和清除；当肝脏发生纤维化时其解毒功能下降使机体受损[12]。本研究发现，杭白菊具有干预肝纤维化起到保护肝脏的作用，这为杭白菊在临床上开发应用提供科学依据，也可为肝纤维化患者带来福音。