镰形棘豆总黄酮通过TGF-β/Smad3通路抑制骨肉瘤MG63细胞EMT

马金祥，马金兰，马金华

(青海大学医学院,西宁 810016)

骨肉瘤起源于骨间充质细胞，是最常见的原发性恶性骨肿瘤。其每年发病率在不同年龄段略有不同：在0～14岁内为4.0/百万(3.5/百万～4.6/百万)，在0～19岁内为5.0/百万(4.6/百万～5.6/百万)。在儿童易患的癌症中，骨肉瘤发病率排在第8位。骨肉瘤发病率男性高于女性，呈双峰型分布，在10～14岁时出现第1个高峰，与生长激素激增相关；在65岁以上人群中出现第2个高峰，与佩吉特氏病相关。最常见的部位是股骨、胫骨和肱骨。骨肉瘤的5年整体生存率为68%。最佳治疗效果是在骨肉瘤转移前手术完整切除。化疗药物和化疗方案对骨肉瘤的复发和转移依然至关重要。骨肉瘤具有发病率高、耐药性强及易转移等特点，导致其预后差[1]。尽管近年来，科学家们确定了几种分子标记物，但敏感性和特异性欠缺。因此，开发新型药物对原发性骨肉瘤的治疗至关重要。

镰形棘豆(oxytropis falcate)属于棘豆属，主要分布在中国西北部，在西藏和内蒙古被广泛用于民间偏方。其全草在中药中也被广泛使用，主要用于治疗发热、流感、扁桃体炎、咽喉炎、急慢性支气管炎、便血、痢疾等。现代药理学研究发现其具有抑菌、抗氧化、抗炎、止血和抗肿瘤等药效[2]，有效成分主要包括黄酮类、多酚类、多糖及生物碱等[3]。近年研究显示镰形棘豆总黄酮(flavonoids of oxytropis falcate,FOF)具有抗肿瘤效果，但主要集中在对肝癌的治疗研究中[4]，对其他肿瘤的作用效果研究少见报道。2016年，李钦[5]发现FOF可抑制由转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)引起的肾纤维化，其主要是通过抑制TGF-1β/Smads通路实现的。该通路在大部分转移性肿瘤中被激活，促进肿瘤细胞EMT转化[6]。因此，推测FOF可能会通过抑制TGF-1β/Smads通路抑制转移性肿瘤的转移能力。

为探索FOF是否可通过TGF-β/Smad3通路抑制骨肉瘤细胞EMT及其分子机制，为FOF首次应用于抗骨肉瘤转移提供理论支持，本研选取骨肉瘤细胞MG63细胞系作为研究对象进行实验。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 MG63细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM高糖培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自北京四季青生物科技有限公司，胰蛋白酶、RIPA裂解液、超敏型ECL检测试剂、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)配制试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE电泳液及蛋白免疫印迹(Western blot)转膜液均购自上海碧云天生物技术有限公司，E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、p-Smad3、磷酸化转化生长因子β受体Ⅱ(p-TGF-βRⅡ)单克隆抗体购自英国Abcam公司，Transwell小室购自Millipore公司，TRIzol、反转录试剂盒、qPCR试剂盒均购自日本Takara公司，TGF-β1 ELISA试剂盒购自上海酶联生物公司。引物信息：Twist正向引物5′-CTT GCC AAT CAG CCA CTG AC-3′;反向引物5′-CCA GTT TGA TCC CAG CGT TT-3′；Snail正引物 5′-CCT TCA GGC CAC CTT CTT TG-3′;反向引物 5′-TCC AGT AAC CAC CCT GCT GA-3′;GAPDH正向引物:5′-CCG AGG GCC CAC TA A AGG-3′；反向引物:5′-GCT GTT GAA GTC ACA GGA GAC AA-3′,以上引物由日本Takara公司合成。FOF由甘肃省中医药研究院中药研究所提供。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将MG63细胞用含有10% FBS的DMEM高糖培养液，置于37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁生长至80%～90%融合度时传代。

1.2.2细胞增殖实验 取对数生长期细胞，胰酶消化成单细胞，并用含有10% FBS的高糖型DMEM培养基配制成1×105/mL浓度的单细胞悬液。于每孔100 μL加入到96孔板中，置于37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养24 h，待贴壁后，分别加入0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的FOF，其中0 μg/mL组加入相同体积的二甲基亚砜(DMSO)作为空白组，继续培养24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的四甲基偶氮唑蓝(MTT)20 μL，培养4 h，弃去培养基，每孔加入150 μL DMSO室温避光溶解MTT，于490 nm处在酶标仪上检测吸光度(OD)值。为排除药物的诱导凋亡作用所引起的对以下实验结果的影响，同时保证药物的作用效果，本研究选取48 h作为处理时间、≤半数致死浓度(IC50)的两个梯度浓度(25.0 μg/mL组、50.0 μg/mL组)作为处理浓度，进行后续实验。

1.2.3细胞迁移实验 在超净工作台中，将Transwell小室放入24孔板中，备用。取对数生长期细胞用0、25%胰酶消化并用无血清培养基配制成1.5×105/mL的单细胞悬液，以每孔400 μL加入到Transwell小室上室中，并在下室中加入600 μL含有20%血清的培养基，每组设6个平行对照。并分别加入0 μg/mL、25.0 μg/mL、50.0 μg/mL的FOF，其中0 μg/mL组加入相同体积的DMSO作为空白组，放入37 ℃、含5% CO2培养箱中，培养48 h后，取出培养板，将Transwell小室取出，放入-20 ℃无水甲醇固定5 min，棉签轻轻拭去上室中未迁移细胞后，0.25%结晶紫染色5 min，PBS洗去未染色结晶紫，显微镜下观察拍照，并随机选取6个视野计数细胞，统计迁移细胞数。

1.2.4ELISA实验 取各组细胞，胰酶消化并用含有10% FBS的高糖型DMEM培养基配制成1×104/mL的单细胞悬液，以每孔1 mL种植于6孔板中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养至80%融合后，加入不同浓度药物，每组设6个平行对照，于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h，收集上清液，离心后，按照ELISA试剂盒说明书进行实验。

1.2.5qPCR实验 MG63细胞在培养瓶底融合度达到80%后，加入不同浓度药物处理48 h后，用TRIzol法提取总RNA，步骤如下：PBS洗涤MG63细胞，加入TRIzol于冰上裂解5 min，收集裂解液，13 000 r/min离心，收集上清液，加入氯仿，静置离心，吸取上清液加入异丙醇，静置离心，弃上清液，75%乙醇清洗沉淀，离心弃上清液，保留沉淀干燥，用焦碳酸二乙酸(DEPC)水溶解。然后按照日本Takara反应试剂盒依次经过去除基因组DNA反应、反转录反应和qPCR进行扩增，扩增程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃、30 s，40循环数。

1.2.6Western blot实验 取各组细胞，PBS洗涤后，加入RIPA裂解液在冰上裂解细胞，待细胞裂解后收集于离心管中，继续裂解30 min，13 000 r/min离心，收集上清液，测定蛋白浓度，加入4×上样缓冲液，煮沸5 min，充分变性，-20 ℃保存备用。制胶：10%分离胶+5%浓缩胶；按蛋白浓度确定上样量；然后经过电泳，转膜，封闭，一抗孵育过夜，PBS洗涤，二抗室温孵育1.5 h，PBS洗涤，ECL发光液显色，X射线显影，拍照，用Image pro plus软件分析光密度值。

2 结 果

2.1FOF对MG63细胞增殖的影响 在相同时间下，随着FOF处理浓度的升高，MG63细胞增殖抑制率逐渐升高，其中处理24、48、72 h的IC50分别为80.84、44.90、31.36 μg/mL；在相同浓度下，随着处理时间的增长，MG63细胞增殖抑制率也逐渐升高。见图1。

图1 FOF对MG63细胞增殖的影响

A：空白组；B:25.0 μg/mL组；C:50.0 μg/mL组；D:定量分析；a：P<0.05，与空白组比较

图2 FOF对MG63细胞迁移的影响

2.2FOF对MG63细胞迁移的影响 随着FOF浓度的增大，迁移细胞逐渐减少，与空白组比较，25.0 μg/mL组和50.0 μg/mL组迁移细胞数均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05),见图2。

2.3FOF对MG63细胞E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响 随着FOF浓度的增大，E-cadherin表达逐渐增多，Vimentin表达逐渐减少，见图3。

图3 FOF对MG63细胞中E-cadherin、Vimentin蛋白水平的影响

2.4FOF对MG63细胞Snail1、Twist mRNA表达水平的影响 随着FOF浓度的增大，Snail1、Twist mRNA表达水平逐渐减少，经统计，与空白组比较，25.0 μg/mL组和50.0 μg/mL组中Snail1、Twist mRNA表达变化差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

2.5FOF对MG63细胞上清液中TGF-β1水平的影响 随着FOF浓度的增大，MG63细胞上清中TGF-β1水平逐渐减少。经统计，与空白组[(10.35±1.64)ng/mL]比较，25.0 μg/mL组[(6.98±0.91)ng/mL]和50.0 μg/mL组[(3.70±0.54)ng/mL]中TGF-β1水平变化差异有统计学意义(P<0.05)。

a:P<0.05，与空白组同种mRNA比较

图4 FOF对MG63细胞Snail1、Twist mRNA表达水平的影响

图5 FOF对MG63细胞中p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白的影响

2.6FOF对MG63细胞p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白表达的影响 随着FOF浓度的增大，p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白水平逐渐减少，见图5。

3 讨 论

近年，由镰形棘豆中提取的黄酮类物质逐步被各研究者发掘出具有抗肿瘤效果。杨光明等[7]发现FOF可通过调控Bcl-2/Bax的比率诱导肝癌SMMC-7细胞系凋亡。陈晓红等[8]进一步对FOF引起SMMC-7721细胞凋亡的途径进行探索，发现FOF可诱导细胞内Caspase-3、Cyt C蛋白表达水平升高，并伴随线粒体膜电位发生变化，揭示FOF可通过线粒体凋亡途径诱导SMMC-7721细胞凋亡。但是其对骨肉瘤的抗癌效果及对肿瘤转移的影响并未见报道。因此，本研究选取MG63细胞为研究对象探索FOF抗骨肿瘤效果及对EMT的影响。通过MTT细胞增殖实验发现FOF以时间和浓度依赖的方式抑制MG63细胞增殖，提示FOF具有一定的抗MG63细胞增殖的能力。考虑到时间过长或浓度过高，细胞凋亡严重，而时间过短或浓度太低，对细胞代谢无影响，因此本研究选取48 h时的最接近IC50的左右两个FOF浓度处理MG细胞。

EMT能够使上皮细胞获得类似于间质细胞的特征，使其具有较高的转移能力。在大部分肿瘤获得转移能力的过程中，伴随EMT转化相关蛋白及通路发生异常[9]。在EMT转化过程中，直接相关的蛋白有E-cadherin、N-cadherin、Vimentin，其中E-cadherin表达下调，N-cadherin和Vimentin表达上调。本研究发现经FOF处理后，MG63细胞迁移能力下降，E-cadherin蛋白表达上升，Vimentin蛋白表达下降。提示FOF可逆转MG63细胞EMT，从而抑制MG63细胞迁移。研究发现[10]转录因子Snail1、Twist通过特异性识别E-box碱基序列下调E-cadherin mRNA表达，上调Vimentin mRNA表达，促进细胞EMT。本研究通过qPCR实验发现FOF具有降低MG63细胞中Snail1、Twist mRNA的能力。以上提示FOF可通过抑制MG63细胞中Snail1、Twist mRNA表达，降低相应蛋白水平，逆转EMT，达到抑制MG63细胞转移的效果。

研究发现TGF-β1/Smads通路调控Snail1、Twist表达[11]。在多数肿瘤当中异常激活的TGF-β1/Smads通路通过诱导Snail1过表达介导EMT[12]。TGF-β1与细胞表面TGF受体结合导致TGF-βRⅡ磷酸化激活，并进一步磷酸化激活Smad3，p-Smad3进入细胞核启动Snail1、Twist表达。基础研究发现很多药物均可通过抑制TGF-β1/Smads通路逆转肿瘤细胞EMT[12]。本研究发现FOF可降低MG63细胞上清液中TGF-β1的水平及MG63细胞中p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白水平。提示FOF可抑制MG63细胞分泌TGF-β1的能力，进而抑制Smad3、TGF- βRⅡ磷酸化水平。

综上可知FOF对MG63细胞增殖具有抑制作用，并可通过抑制TGF-β1/Smads过度激活，逆转MG63细胞EMT，从而降低MG63细胞转移。由于与EMT转化相关的信号通路还涉及其他多条通路，FOF是否还通过其他途径逆转EMT转化，还需进一步实验。