20-羟二十烷四烯酸对人胎盘绒毛膜滋养细胞生物学行为的影响

卢帅军 朱长玲 喻莹 王卫华

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠妇女常见的多系统紊乱综合征之一。随着国内二胎政策的开放，高龄产妇增加，PE发生率呈上升趋势[1]。目前关于PE的发病机制尚不清楚，但普遍认为其病理学特征是子宫螺旋动脉重塑障碍[2]。重塑中任何环节异常，都可能引发子痫前期、胎儿生长受限等。本课题组前期研究已证实，20-羟二十烷四烯酸（20-HETE）作为参与重塑过程及血管维护的多个信号转导系统的上游调控因子，若其代谢异常，相关信号则不能准确转导，会导致螺旋动脉重塑障碍和血管功能紊乱，从而引发子痫前期[3]。本研究通过体外培养人胎盘绒毛膜滋养细胞并追踪20-HETE及其抑制剂HET0016对其基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）浓度及mRNA表达的影响，以探讨相关机制。

1 材料和方法

1.1 材料 人胎盘绒毛膜滋养细胞购自美国Sciencell公司。20-HETE、HET0016购自美国Cayman公司。human MMP-9 Quantikine elisa Kit、human NGAL Quantikine elisa Kit购自美国R&D公司。RNA提取试剂盒（上海久盛医疗用品有限公司），反转录试剂盒（日本Takara公司），实时荧光定量试剂盒（美国Promega公司），化学发光凝胶摄像分析系统（法国ChemilmagerTMXRS），PCR扩增仪（美国ABI公司）。DNA ladder marker、MMP-9及NGAL引物由上海生物工程公司合成。

1.2 最佳药物浓度的选择及实验分组 人胎盘绒毛膜滋养细胞为贴壁生长方式，采用常规方法进行细胞复苏、传代、冻存等[3]。（1）20-HETE 细胞培养液配置：采用浓度梯度法，用培养基稀释100μg/ml的20-HETE溶液，使 20-HETE 浓度依次为 0、5、10、20、40ng/ml。将不同浓度的20-HETE培养基加入生长状态良好、对数生长期的细胞中，进行药物最佳作用浓度及时间的测定。（2）HET0016细胞培养液配置：按说明书要求，用二甲基亚砜溶解HET0016粉末，溶解后浓度为10mg/ml；采用浓度梯度法，用培养基稀释10mg/ml的HET0016溶液，使 HET0016 终浓度依次为 0、5、10、20、40μg/ml。将不同浓度HET0016培养基加入生长状态良好、对数生长期的细胞中，进行药物最佳作用浓度及时间的测定。（3）采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长状况，筛选出10ng/ml 20-HETE对人胎盘绒毛膜滋养细胞干预48h的增殖影响最明显，10μg/ml HET0016对人胎盘绒毛膜滋养细胞干预48h的增殖最明显[3]。（4）按上述结果，将常规培养细胞设为正常对照组，相应二甲基亚砜浓度设为药物介质组，10ng/ml 20-HETE设为20-HETE组，10μg/ml HET0016设为HET0016组。

1.3 细胞培养 收集对数生长期人胎盘绒毛膜滋养细胞，按实验分组要求，用已配好的相应药物最佳浓度培养液调整细胞悬液密度1×105/ml，于24孔板内加入1ml/孔细胞悬液，每组设6个复孔；置于5%CO2、37℃孵箱内培养48h。收集每孔细胞悬液以备ELISA检测。剩下的每孔底物细胞用PBS漂洗3次，去净PBS，以备Trizol法提取细胞总RNA。

1.4 人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL浓度的检测 采用ELISA法。将上述实验过程中收集的人胎盘绒毛膜滋养细胞悬液在常温下低速离心，收集上清液。每组设6个复孔，参照ELISA试剂盒说明书进行操作。使用MMP-9和NGAL试剂盒提供的标准品与样本平行检测，再通过Excel软件生成标准曲线及方程，计算各组样本MMP-9、NGAL浓度。

1.5 人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法。每孔加入Trizol试剂500μl，吹打3～5min使细胞脱落，将细胞悬液移入不含RNAse的无菌EP管中，室温静置5min使其充分裂解；加入氯仿 100μl，剧烈震荡 30s，室温静置 5min，4℃12 000g离心15min，将上清液转移至新的EP管中；加入等体积异丙醇，震荡10s，室温静置10min，4℃12 000g离心10min，弃上清液；加入冰冻的75%乙醇1ml，涡旋10s，充分洗涤RNA沉淀，4℃ 7 500g离心5min；小心吸弃上清液后，在超净工作台内敞开管盖，室温下风干8min，加入30μl灭菌DEPC水溶解沉淀，并分装于0.2ml离心管中，留10μl进行RNA浓度、纯度和完整性测定；其余提取mRNA逆转录成cDNA后扩增，按说明书进行操作。在Primer Bank检索人MMP-9和NGAL基因全序列，用primer 5.0软件设计引物，并在基因库内检索确认，见表1。1.5%琼脂糖凝胶电泳后，上凝胶摄像分析系统分析（以GAPDH扩增片段为密度标准品对各组进行光密度扫描分析），计算各组MMP-9、NGAL mRNA相对表达量。

表1 MMP-9、NGAL和GAPDH引物序列及相关参数

1.6 统计学处理 应用GraphPad Prism7统计软件，计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 20-HETE及HET0016对人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL浓度的影响 与正常对照组比较，药物介质组人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL浓度差异均无统计学意义（均P＞0.05），20-HETE组人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL浓度均明显降低（均P＜0.05），HET0016组人胎盘绒毛膜滋养细胞 MMP-9、NGAL浓度均明显升高（均P＜0.05），见表2。

2.2 20-HETE及HET0016对人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL mRNA相对表达量的影响 与正常对照组比较，药物介质组人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL mRNA相对表达量差异均无统计学意义（均P＞0.05），20-HETE组人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL mRNA相对表达量均明显降低（均P＜0.05），HET0016组人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL mRNA相对表达量均明显升高（均P＜0.05），见表3和图1。

表2 20-HETE及HET0016对人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL 浓度的影响（ng/ml）

表3 20-HETE及HET0016对人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL mRNA相对表达量的影响

图1 人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9、NGAL mRNA表达的电泳图（a：正常对照组；b：药物介质组；c：HET0016组；d：20-HETE 组）

3 讨论

在妊娠初期，绒毛膜滋养细胞侵袭螺旋动脉管，与血管内皮细胞、平滑肌细胞相互作用而介导其凋亡，同时分泌MMP降解螺旋动脉管壁的弹性基质，分泌无定型类纤维素样物质取代细胞外基质，形成绒毛外滋养细胞及纤维素样物质，从而导致螺旋动脉重塑[4]。重塑中任何环节异常都可能导致重塑不全，引起一系列妊娠并发症。MMP是参与基质降解的关键分子，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，切除前肽氨基末端转化为活性酶[5]。MMP-9是一种锌依赖性蛋白酶，参与炎症、组织重塑、基质结合生长因子和细胞因子的激活等[6]。妊娠期母体MMP-9浓度为非妊娠期的10余倍[7]。NGAL是一种公认的抑菌功能蛋白，为脂多糖家族的一员，首次在中性粒细胞中发现。在正常妊娠过程中，NGAL浓度升高可促进MMP-9浓度的变化[8]。在妊娠早期胎盘形成过程中，MMP-9与NGAL平衡紊乱是PE患者细胞外基质和螺旋小动脉细胞滋养细胞侵袭异常的原因之一[8]。

20-HETE是细胞色素-P450家族成员4A和4F介导的花生四烯酸代谢产物，主要通过调节血管张力、肾脏水钠平衡等参与血压、血糖的相关作用机制，目前作为对高血压、高血糖的潜在治疗药物靶点，受到广泛关注[9]。本课题组前期已证实，20-HETE可促进人绒毛膜滋养细胞和子宫血管平滑肌细胞的增殖，抑制人绒毛膜滋养细胞的浸润能力（迁移、浸润作用）[3]。20-HETE作为一种血管收缩剂和促尿钠排泄类花生酸，既是维持生理条件下稳态平衡的重要物质，又是很多疾病发生、发展中的关键因素[10]。

本研究结果证实在体外培养过程中，20-HETE可抑制人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9与NGAL浓度及表达，而其抑制剂HET0016起促进作用。多项研究表明，MMP-9对维持人类正常妊娠具有重要作用，其在胎盘组织及孕妇血清中的水平随着妊娠进展而不断升高，而其表达紊乱常与不良妊娠事件有关，如PE患者胎盘、血清中MMP-9表达明显低于正常同期孕妇[11-12]。另一方面，体外实验表明NGAL可通过激活MMP-9前体，结合成NGAL/MMP-9二聚体，促进MMP-9生物学功能的正常发挥[13]。综合上述研究，可以发现NGAL、MMP-9以及两者形成的复合物相互协作与彼此平衡，对保证绒毛膜滋养细胞的侵袭功能非常重要，可能是螺旋动脉正常重塑的相关机制之一。因此，NGAL与MMP-9之间平衡关系的打破，可能引起绒毛膜外滋养细胞消化螺旋动脉基质失败，进而引起螺旋动脉重塑障碍，成为导致PE的一个重要原因。但目前对PE患者胎盘中NGAL及MMP-9异常表达的机制尚未清楚。

已有文献表明，20-HETE是血管内皮细胞、平滑肌细胞等细胞内多个信号转导系统（HIF-1α、P13K/AKT/FOSL1等）的上游调控因子或第二、第三信使，参与细胞增殖、分化、迁移等调控，是相关功能调节的关键因子[14]。同样，NGAL可通过HIF-1α和PI3K/AKT途径来调节血管内皮生长因子和FAK磷酸化，协同MMP-9参与细胞生长、黏附等[15-16]。因此，20-HETE可能通过下调相关信号通路，从而抑制滋养细胞中NGAL的表达，进而引起MMP-9表达的下降。本研究首次证实20-HETE对人胎盘绒毛膜滋养细胞MMP-9和NGAL浓度及表达的抑制作用，这为探讨螺旋动脉重塑及相关妊娠并发症提供新的依据。