锌指蛋白545在结直肠癌中的表达及其临床意义

潘烽平 李彦 张明明 陈一鹏

锌指蛋白545（ZNF545）是ZFP转录因子家族中的新成员之一，位于染色体19q13.1，该区域在肿瘤中频发杂合性缺失[1]。ZNF545在肿瘤中的表达沉默受其启动子区的甲基化调控，相关研究发现在原发性结直肠癌[2]、胃癌[3-4]、肝癌[5-6]、乳腺癌[7]、多发性骨髓瘤[8]中均能检测到ZNF545的启动子区频繁发生甲基化，但在正常组织中甲基化发生率极低。ZNF545可以通过抑制肿瘤细胞的增殖来诱导其凋亡，继而抑制肿瘤的发生、发展[1-2,7]。目前关于ZNF545在结直肠癌中的表达及其临床意义的报道较少。笔者观测了ZNF545在结直肠癌组织及配对癌旁正常组织中的蛋白表达，并分析了其与结直肠癌患者临床特征及生存预后的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年3月至2018年2月在本院接受结直肠癌根治术的32例患者为研究对象，收集其结直肠癌组织及配对癌旁正常组织标本（均经术后病理检查证实）；所有患者术前未接受过放化疗，组织标本的使用取得患者或家属的知情同意，本研究经医院伦理委员会审查通过。另购买1份组织芯片（包含136例结直肠癌组织及配对癌旁正常组织，上海芯超生物有限公司）。1.2 总RNA的抽提、反转录和qRT-PCR 按照Trizol试剂盒说明书抽提32例结直肠癌组织及癌旁正常组织的总RNA。采用Invitrogen公司的Reverse Transcription System试剂盒反转录合成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行qRT-PCR。按以下条件上机反应：95℃预变性10min；95℃变性 10s，退火 60℃1min，共45个循环。以GAPDH为参照，计算ZNF545在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的mRNA相对表达量。

1.3 免疫组化 组织芯片用ZNF545抗体（Abcam，1∶200，ab228946）于4℃孵育过夜；用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗于室温孵育30min。由2位病理科医生根据染色强度和阳性细胞比例进行独立评分。染色强度的评分标准：无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分；阳性细胞比例的评分标准：0%为0分，＞0%～5%为 1分，＞5%～30%为2分，＞30%～60%为3分，＞60%为4分。染色强度与阳性细胞比例的评分之和为免疫组化评分，＞3分为高表达，≤3为低表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 25.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用配对样本t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，计算ZNF545蛋白高、低表达患者的5年生存率，并采用log-rank法比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁正常组织中ZNF545 mRNA相对表达量比较 32例结直肠癌组织中ZNF545 mRNA相对表达量为0.43±0.16，明显低于癌旁正常组织的 1.02±0.35，差异有统计学意义（t=-9.19，P＜0.05），见图1。

2.2 结直肠癌组织与癌旁正常组织中ZNF545蛋白表达比较 对组织芯片进行免疫组化染色，可见ZNF545蛋白主要存在于正常结直肠黏膜细胞质和细胞核中，呈弥漫性棕黄色，见图2（插页）。结直肠癌组织中ZNF545蛋白低表达率为65.4%（89/136），高于配对癌旁正常组织的 25.7%（35/136），差异有统计学意义（χ2=43.2，P＜0.05）。

图1 结直肠癌组织与癌旁正常组织中ZNF545 mRNA相对表达量比较（与癌旁正常组织比较，*P＜0.05）

图2 组织芯片结直肠癌组织与配对癌旁正常组织中ZNF545蛋白表达情况（免疫组化染色；a-b：×5；c-d：×40）

2.3 结直肠癌组织中ZNF545蛋白表达与患者临床特征的关系 ZNF545蛋白低表达与患者肿瘤直径、浸润深度、TNM分期相关（均P＜0.05），与患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、淋巴结转移无关（均P＞0.05），见表1。

表1 ZNF545蛋白表达与患者临床特征的关系[例（%）]

2.4 ZNF545蛋白表达与结直肠癌患者生存预后的关系 ZNF545蛋白低表达患者的5年生存率为53.6%，明显低于ZNF545蛋白高表达者的76.5%，差异有统计学意义（χ2=8.75，P＜0.05），见图 3。

图3 ZNF545蛋白高、低表达结直肠癌患者生存曲线

3 讨论

结直肠癌是全球范围内高发病率、高病死率的恶性肿瘤之一[9]。在我国恶性肿瘤中，结直肠癌发病率居第3位，病死率居第4位[10]。现有的生物标志物仍不能有效地预测早期结直肠癌，中晚期结直肠癌患者的5年生存率不容乐观[11]。早期发现，结直肠癌是提高患者生存的关键。因此，进一步深入探讨结直肠癌发生和发展的分子机制，将有助于寻找到特异度、灵敏度更高的生物标志物，以提高早期结直肠癌的诊断率。

ZFP是真核生物中最大的转录因子家族，广泛参与肿瘤的发生、发展。其中约三分之一在其保守结构域上含有 Krüppel-associated box（KRAB），称为 KRAB-ZFP，是ZNF家族中最经典的一类[12]。正是由于KRAB-ZFP这种特殊的结构特点，即KRAB结构域能与其协同蛋白的氨基端相结合，而C2H2-锌指结构可与基因启动子区相结合，使其在细胞增殖、分化、凋亡、正常细胞向恶性细胞转化等过程中发挥着重要的调节作用[13]。ZNF545是KRAB-ZFP家族的新成员之一，位于染色体19q13.1，该区域在多种肿瘤中频发杂合性缺失。已有研究报道，在胃癌、肝癌及乳腺癌等实体肿瘤中，ZNF545基因启动子区CpG岛频发甲基化，使其在癌组织中呈低表达或缺失表达。ZNF545可以通过抑制肿瘤细胞的增殖来诱导其凋亡，继而抑制肿瘤的发生、发展。在结直肠癌中，ZNF545同样存在甲基化，并在结直肠癌细胞中发挥着抑癌基因的生物学作用[2]。

为研究ZNF545在结直肠癌组织及其癌旁正常组织中的表达情况，笔者首先收集并检测了32例结直肠癌组织及其癌旁正常组织标本ZNF545 mRNA表达情况，结果显示结直肠癌组织中ZNF545 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织。为进一步验证ZNF545蛋白在结直肠癌组织中是否呈异常低表达，笔者购买了结直肠癌组织芯片并进行免疫组化检测，结果发现在结直肠癌组织及其配对癌旁正常组织中，ZNF545蛋白均主要定位于细胞核及细胞质中；与癌旁正常组织比较，结直肠癌组织中ZNF545蛋白呈低表达，差异有统计学意义；进一步分析ZNF545蛋白表达与患者临床资料的关系，结果发现结直肠癌组织中ZNF545蛋白低表达率与肿瘤直径、浸润深度、TNM分期有关，与患者性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结转移无关。此外，结直肠癌患者ZNF545蛋白低表达者5年生存率较高表达者明显下降。可见，ZNF545在结直肠癌组织中呈异常低表达，与结直肠癌患者的不良预后有关。

综上所述，ZNF545在结直肠癌组织中呈低表达，与患者肿瘤直径、浸润深度、TNM分期及生存预后有关。关于ZNF545在结直肠癌发生、发展中发挥的调控作用及其分子机制，有待进一步深入研究。