基于低场核磁共振技术的咸鸭蛋腌制过程水分及质构特性变化

龙 门 张文豪 郑素玲 齐安琪 詹 歌

(1. 滁州学院生物与食品工程学院，安徽 滁州 239000；2. 滁州市食品加工研究院，安徽 滁州 239000)

咸鸭蛋是中国传统蛋制品，其蛋黄沙糯的质地和咸香的风味深受消费者喜爱，除直接食用外，也被广泛用于中国传统食品——月饼、粽子等中[1]。质构特性和盐含量是咸鸭蛋成熟的重要品质特性，目前研究主要集中在腌制工艺对其凝胶强度、持水性和盐含量等指标的影响[2]；同时不同的腌制环境(温度、湿度)对咸鸭蛋成熟期有显著的影响，而凝胶强度、持水性和盐含量等指标的测定都需要对咸蛋进行破坏性检测，检测周期长，且造成原料损耗。低场核磁共振技术( low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)可通过测定水分子的弛豫特性T2、与食品组分的结合状态判断食品中自由水、结合水、不易流动水的迁移[3-4]，同时可获得氢离子密度图像，分析食品中不同水分的分布状况[5-6]。目前，LF-NMR技术已被广泛应用于肉制品、果蔬、面制品等食品领域。秦影等[7]在对大黄鱼鱼糜的研究中发现，水分状态及含量与质构指标和保水率之间存在相关性，盐离子对鱼糜凝胶的强度、显微结构和水分分布都有影响[8]；徐雷等[9]研究表明鸡蛋的气室高度、蛋黄指数等与弛豫参数之间存在相关性，可利用弛豫参数预测鸡蛋的货架期，也有学者[10]发现白煮蛋表观品质的变化与蛋清和蛋黄中水分分布的变化相关。咸蛋在腌制过程中蛋清和蛋黄的质构特性可能受到盐离子的影响，同时又与其水分状态及含量变化相关。

目前关于结合LF-NMR技术研究腌制食品在加工过程中水分分布及品质变化规律的报道甚少。基于此，本研究拟利用该技术深入分析咸鸭蛋在腌制过程中水分分布变化规律及品质的变化，以期应用低场核磁技术预测咸鸭蛋成熟度和品质，以拓展此技术在腌制类食品品质评价中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化钠、硝酸银：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

硝酸、乙醇、硫酸铁铵、硫氰酸钾、亚铁氰化钾、乙酸锌：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

冰乙酸：分析纯，天津市津东天正精细化学试厂；

食盐：食品级，市售；

新鲜鸭蛋：滁州市白云超市。

1.2 仪器与设备

物性测试仪：TA-XTplus型，英国Stasle Micro System公司；

恒温加热磁力搅拌器：Cy-2型，巩义市予华仪器有限责任公司；

快速水分测定仪：M2-08型，杭州科博仪器有限公司；

电子天平：JA5003J型，上海越平科学仪器有限公司；

电子分析天平：FA2204B型，上海越平科学仪器有限公司；

低场核磁：MeSONMRI3-060V-I型，苏州(上海)纽迈电子科技有限公司；

料理机：C010-7067型，九阳股份有限公司；

多功能电磁炉：C21-ST2125型，广东美的生活电器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 咸鸭蛋腌制工艺 按质量比为5∶4将洗净晾干的鸭蛋放入20%的食盐腌制液中，最上层压以适量重物以保证所有鸭蛋都浸没在腌制液中，在(20±5) ℃下进行腌制，每隔3 d翻动原料蛋1次。每隔5 d随机选取一定数量的咸鸭蛋，将咸鸭蛋用温开水洗净后，放于沸水的蒸笼上蒸20 min，测定各项理化指标。

1.3.2 水分测定 按GB 5009.3—2016的直接干燥法执行。

1.3.3 NaCl测定 按GB 5009.44—2016的间接沉淀滴定法执行。

1.3.4 低场核磁共振分析方法 根据Aursand等[11]的方法略作修改：分别取一定质量(m)的蛋清凝胶或蛋黄凝胶放入直径60 mm的玻璃试管中，将样品管置于NMR探头中(保持温度32 ℃)，使用CPMG序列测试横向弛豫时间T2，测试条件：接收机带宽100 kHz，采样起始点控制参数0.200 ms，重复采样时间间隔2 500.000 ms，模拟增益 10.0 db，90°和 180°脉宽分别为16， 31 μs，采样点数469 804，数字增益2，数据半径1，累加扫描次数8，回波个数18 000。试验取4份平行，每份平行测3次。然后对其进行反演，得到T2谱图，对峰面积进行累计积分，得到峰面积A。

1.3.5 低场核磁成像分析方法 根据刘斯琪[12]的方法略微修改：将咸鸭蛋洗净后置于NMR探头中(保持温度32 ℃)，采用多层自旋回波序列(Multi-Slice Echo，MSE)进行质子加权成像，Y轴为选层梯度，X轴为相位梯度，Z轴为读出梯度，90°和 180°软脉冲均为20.000 ms，重复采样时间为500.000 ms，半回波时间为20.000 ms，选层梯度脉冲(90°)对应的补偿梯度为1.4%，选层梯度脉冲(180°)对应的补偿梯度脉冲为6.6%。

1.3.6 质构分析方法 将冷却到室温的蛋清或者蛋黄切成近似20 mm×20 mm×20 mm的正方体，采用物性测试仪测定其质构参数。使用型号为P/36R探头对样品进行连续两次50%的挤压。测定条件：测前速度1 mm/s；测试速度4 mm/s；测后速度4 mm/s；压缩程度50%；停留时间5 s；数据采集速率400 pps；触发值0.196 N。

1.3.7 持水力测定 参考Kocher等[13]的方法并略有修改，取3 g冷却到室温蛋清凝胶样品加入离心管中，12 000 r/min 离心15 min，去除离心出的水分，称量凝胶质量。按式(1)计算持水性：

WCH=(m1-m0)÷(m2-m0)×100%，

(1)

式中：

WCH——凝胶持水力，%；

m1——离心后凝胶质量，g；

m0——离心管质量，g；

m2——离心前凝胶质量，g。

1.4 数据统计处理

所有数据利用Microsoft Excel进行统计处理，采用Origin 9.0进行作图分析。不同平均值之间用SAS 8.2(SAS Institute Inc, Cary, North Carolina, USA)统计软件的GLM程序(General Linear Model procedure)中的邓肯氏多重比较法(Duncan' s Multiple Range Test)进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 咸鸭蛋腌制过程中盐分和水分的变化

由图1可知，腌制过程中，蛋清与蛋黄中水分含量显著降低(P<0.05)，而盐分含量显著上升(P<0.05)，在腌制后期变化逐渐趋于平缓。腌制过程中，水分和盐离子从蛋壳上的空隙迁出和迁入，蛋黄中水分的降低程度大于蛋清，而盐分含量的升高程度小于蛋清，可能是由于：① 蛋清和蛋黄中水分含量的差异导致渗透压不同，物质迁移的速率不同； ② 物质迁移过程中遇到的阻力不同，对迁移速率的影响不同，蛋黄的密度相比于蛋清更高，内部的脂肪等物质对盐分的阻滞力度更大[14-15]；③ 蛋清和蛋黄中不同的蛋白质种类，与水分的结合程度不同，也会对水分的迁移有所影响[16-17]。

图1 不同腌制时期咸鸭蛋蛋黄、蛋白水分和盐分变化Figure 1 Moisture and salt content of albumin and yolk gel during salting period

2.2 腌制过程中蛋清和蛋黄水分分布及迁移的变化

蛋清凝胶的反演图谱中共有3个峰，分别为T21(0.1～10.0 ms)、T22(10～100 ms)和T23(100～1 000 ms)，而蛋黄的反演图谱有4个峰，各自是T21(0.1～2.0 ms)、T22a(8～30 ms)、T22b(40～150 ms)和T23(150～500 ms)；蛋清和蛋黄中弛豫时间为T21的为结合水，T22、T22a和T22b的为不易流动水，T23的为自由水。T2弛豫曲线的积分面积正比于氢质子的含量，即水分含量，而不同积分面积占总积分面积的百分比可表示不同状态水占总水分的相对比例[18-21]。

如图2(a)所示，腌制过程中，蛋清凝胶的弛豫曲线向右偏移，在腌制后期曲线的变化趋于稳定，表明蛋清凝胶中水分受到的束缚力减弱；图3(a)反映了3种状态水的相对比例变化情况，其中结合水和不易流动水的相对比例在下降，而自由水的相对比例在上升；蛋清凝胶对水分束缚力减弱的原因可能是凝胶结构中孔径变大[22]，同时，蛋白质与水分的结合作用被削弱[23-24]。因为腌制过程中，渗入蛋清中带电的钠离子和氯离子，一方面会屏蔽蛋白质上的电荷，降低蛋白质间的斥力，蛋白质易于相互靠近[17,25]；另一方面会影响维持蛋白质结构的二硫键、氢键和疏水键等次级键，并使得蛋白质内部的疏水键暴露，在疏水相互作用和分子间二硫键作用下，靠近的蛋白质会相互聚集[24]；在热诱导凝胶的形成过程中，蛋白质之间过早的靠近和聚集，更易于形成无规卷曲结构，造成凝胶结构中孔径较大，凝胶对不易流动水分的束缚力降低，滞留的水分易于转变为自由水[17]；同时，疏水键的暴露也会减弱蛋白质与水分的结合作用，而盐离子会破坏蛋白质的亲水基团与水分子之间的氢键等作用力， 结合水与凝胶结构的结合度降低，水分的自由度增加[23]。

由图2(b)可知，腌制过程中蛋黄的弛豫曲线向左偏移，表明蛋黄中水分受到的束缚力增强，由图3(b)可得结合水的相对含量增加，而自由水的相对含量前期增加后期降低。蛋黄中水分受到束缚力增强的原因可能是形成了脂蛋白—水—NaCl复合物，使得水分结合更加紧密[26]。

图2 蛋清和蛋黄凝胶的水分弛豫时间T2Figure 2 Water relaxation time(T2) of egg white and yolk

图3 蛋清和蛋黄凝胶中3种状态水分的相对百分含量Figure 3 Relative content of three states of water in egg white and yolk

蛋黄由浆液和颗粒组成，随着盐离子的渗入，蛋黄颗粒中高密度脂蛋白(HDL)与卵黄高磷蛋白结合的磷酸钙桥中的钙离子被钠离子取代，破坏了蛋黄的颗粒结构。可溶性的卵黄高磷蛋白溶出到浆液中[12,27]，浆液中水分含量较高，在盐离子和脱水作用下黏度增加，其中的蛋白质聚集体相互结合，破坏乳化体系，导致腌制前期部分不易流动水转变为自由水，自由水的相对比例增加[12]，同时，在热诱导作用下聚集的蛋白质与水，形成了脂蛋白—水—NaCl复合物，使得水分受到的束缚力增强[28]。

2.3 腌制过程咸鸭蛋核磁成像变化

图4为咸鸭蛋低场核磁共振成像图，亮度越高，氢质子的密度越高，水分含量越高[4,26]。由图4可知，未腌制时，蛋清中整体较亮，水分分布较均匀，相比于内层浓厚蛋白，外层稀薄蛋白中水分含量更高；而蛋黄中的亮度较暗，其中外层亮度较高，表明外层浆液水分含量更高；随着腌制时间的延长，蛋清中的亮度逐渐降低，亮区逐渐减少到只剩边缘，表明整体水分不断减少，而内层水分向外层迁移；蛋黄中的外层亮度不断降低，外层水分逐渐向蛋清迁移，而内部脂质中氢质子的亮区逐渐集中而亮度不断增加，表明在脱水和盐离子作用下，蛋黄中的脂蛋白颗粒在内部聚集并结合地更加紧密，在腌制后期，蛋清和蛋黄中亮度的变化逐渐趋于稳定，水分的变化也趋于稳定。

图4 咸鸭蛋低场核磁共振成像图Figure 4 Magnetic resonance image of duck egg during salting period

2.4 蛋清和蛋黄质构特性变化

由表1可知，在腌制过程中，蛋清凝胶的硬度、弹性、内聚性和咀嚼性都在显著降低(P<0.05)，后期逐渐稳定，而凝胶持水力前期显著降低(P<0.05)，后期略有升高；硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和凝胶持水力的显著降低(P<0.05)，可能是蛋清凝胶中的孔径增大和交联度的降低[22-24]，而这可能与盐离子和热诱导作用有关，带电的盐离子会破坏蛋白质的次级键，影响蛋白质的极性基团与水分的结合，导致蛋白质的二级结构β-折叠的含量增加，α-螺旋和β-转角的含量下降，同时，内部的疏水键暴露[19]，使相邻蛋白质更易聚集，形成较高分子量的蛋白质单体[29-30]，在热变性阶段高分子量的单体不能完全展开，热交联过程中更易于形成随机无序结构，导致形成的蛋清凝胶结构疏松，单体较大而分布不均匀，交联度低空洞大[31]，且随着盐离子含量增高，凝胶结构可能越疏松，而孔径可能越大，而后期凝胶持水力的增加可能与水分含量的显著降低有关(P<0.05)[32]。

如表2所示，在腌制过程中，咸蛋黄的硬度、内聚性和咀嚼性都在显著增加(P<0.05)，而弹性在降低，质构指标在后期逐渐稳定；硬度、内聚性和咀嚼性的增加，可能是盐离子和热诱导作用，使得蛋黄中成分的在疏水相互作用和二硫键等次级键的作用下结合的更加紧密[17,33]，其中，盐离子导致蛋黄颗粒中的脂蛋白结构改变，可溶性蛋白质脱离，而脱水作用导致浆液的黏度增加,蛋白质等成分因此相互靠近并结合形成聚集体[12,17]；热诱导作用导致水分子运动加剧，脂蛋白质聚集体因体积较大，发生变性后的疏水键和巯基暴露的也较多，在热诱导凝胶形成过程中，数量较多的疏水键和巯基结合形成紧密的脂蛋白—水—NaCl复合物[26]，因此，硬度、内聚性和咀嚼性不断增加。而弹性的降低可能与蛋黄中水分含量的降低和蛋黄硬度的增加有关[34]，而在腌制后期由于蛋白质聚集体的增大和结构紧密，焓变温度增高，耐热性增加，热诱导对质构结构的影响程度降低，质构特性的变化趋于稳定[35]。

表1 蛋清质构特性变化†

† 同列不同字母代表样品存在显著差异(P<0.05)。

表2 蛋黄质构特性变化†

† 同列不同字母代表样品存在显著差异(P<0.05)。

2.5 各指标相关性分析

由表3可知，蛋清硬度、内聚性和咀嚼性与不易流动水(T22)和自由水(T23)存在显著的相关性(P<0.05)[36]。蛋清凝胶中不易流动水截留在蛋清凝胶中，而自由水在凝胶孔径中[21]，不易流动水和自由水与凝胶结合程度下降，凝胶三维网状结构的交联度降低及其孔径变大，因此凝胶的强度下降，维持其网状结构的能力和内部结合力变弱[23]；持水性与自由水的积分面积、弛豫时间T23和水分含量存在显著的相关性(P<0.05)，自由水的流动性较大越容易失去，盐离子对蛋清蛋白质结构的影响，导致凝胶中的自由水的相对含量增加，凝胶的持水性因此下降[34]，而后期由于水分含量的显著降低(P<0.05)，凝胶的持水力也略有增加。

由表2可知，不易流动水(T22)和自由水(T23)的弛豫时间与蛋黄凝胶的硬度、内聚性和咀嚼性存在显著相关性(P<0.05)；腌制过程中，结合水的结合越来越紧密，表明蛋黄中的脂蛋白—水—NaCl凝胶结构更加致密[29]，凝胶的强度，分子间结合力和咀嚼性也因此增加。弹性与水分含量存在显著相关性(P<0.05)，说明蛋黄凝胶的水分含量的减少，能够在一定范围内解释凝胶弹性的降低。

† *表示P<0.05 水平差异显著；**表示P<0.01 水平差异显著。

表4 蛋黄各指标间的相关性†

† *表示P<0.05 水平差异显著；**表示P<0.01 水平差异显著。

3 结论

本研究利用LF-NMR测定在腌制过程中咸鸭蛋水分分布状态，并研究盐离子对咸鸭蛋蛋清和蛋黄凝胶特性的影响，且发现凝胶持性与宏观的质构和持水性等评价指标存在相关性。结果表明，利用LF-NMR技术对咸鸭蛋水分含量及状态的测定可作为预测咸鸭蛋成熟度和品质的参考指标，缩短咸鸭蛋检测周期，减少原料损耗，可为工业化生产咸鸭蛋降低成本提供帮助。