糜子PmASR2基因克隆与表达分析

沈力鸿，刘思辰，王海岗，陈 凌，王君杰，曹晓宁，乔治军

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西太原030031）

作物在自然生长过程中，会受到自然环境中各种生物胁迫和非生物胁迫（干旱、高温、低温、盐渍等）的影响[1]。随着全球气候的极端变化及土地沙漠化和盐渍化，作物生长环境被破坏，非生物胁迫已成为限制农业发展的主要因素[2]。据统计，干旱造成的农业损失超过其他非生物逆境造成的损失总和[3]。因此，提高作物的抗旱性对提高经济效益有决定性的作用。糜子（Panicum miliaceum L.）属禾本科黍属，又称黍、稷、糜，是干旱和半干旱主要作物[4]。糜子生育期短，具有耐旱、耐瘠薄、干旱后复水能力强等特性，在遭受严重干旱后遇水能够快速恢复生长[5]。同时糜子作为C4作物，在C3作物停止干物质积累的水分胁迫条件下，仍能积累干物质[6]，是研究作物耐旱性改良的优异材料[7]。目前，对抗干旱胁迫的研究主要集中在改良栽培方法上[8]、植物抗旱生理方面[9]以及分子方面[10]。如今，从抗旱作物中筛选出抗旱基因是一项研究热点。

ASR全名ABA-stress-ripening，即ABA胁迫成熟响应蛋白，1993年首次在番茄中发现能被逆境胁迫诱导[11]。目前，ASR基因在谷子中已经发现7个[12]，水稻中 6 个[13]，玉米中 9 个[14]。RICARDI等[15]研究发现，在番茄中lsASR1过表达降低了烟草干旱胁迫期间水分损失率；TaASR1的过表达增加了烟草干旱胁迫的存活率[16]。在百合和香蕉中研究发现，ASR基因能赋予拟南芥耐旱性[17-18]；ZmASR1能够提高作物的抗旱性，从而提高产量[19]。在盐生植物亚洲落叶松中，ASR1能提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐性[20]；OsASR1的过量表达通过增加水稻中光合作用提高了耐冷性[21]；大豆ASR基因表达可以增强酵母和烟草细胞抗Cu2+的能力[22]。ASR基因已在多个物种被报道能提高作物抵御非生物胁迫的耐受性，但是在抗逆作物糜子中还未见报道。

本试验通过克隆糜子PmASR2基因及表达分析，旨在了解该基因赋予植物对非生物胁迫耐受性的生理和分子机制。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为河曲红糜子，由山西省农业科学院品种资源研究所提供；所用的克隆载体为pGMSimple-TFast Vector（天根生化北京科技有限公司）；所用的菌种DH5α购自天根生化北京科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗处理 糜子种子用75%的乙醇处理2 min，再用0.1%升汞浸泡5 min后，用无菌水冲洗5次以上，将处理好的种子放入含有充足水分的培养皿中，暗培养下使其发芽；发芽后将长势较好的幼芽放入花盆土培养，在10 000 lx光照16 h黑暗8 h条件下培养10 d后，进行胁迫处理。

1.2.1.1 干旱胁迫处理 将糜子幼苗放入10%的PEG6000 中处理，并以水处理为对照，在 0，1，3，6，9，12，24 h剪取糜子幼苗的根、茎、叶后迅速用液氮冷冻，并放入-80℃冰箱保存。

1.2.1.2 盐胁迫处理 将糜子幼苗放入250 mmol/L NaCl中处理，并以水处理为对照，在 0，1，3，6，9，12，24 h剪取糜子幼苗的根、茎、叶后迅速用液氮冷冻，并放入-80℃冰箱保存。

1.2.1.3 甘露醇糖处理 将糜子幼苗放入200mmol/L甘露醇中处理，并以水处理为对照，在 0，1，3，6，9，12，24 h剪取糜子幼苗的根、茎、叶后迅速用液氮冷冻，并放入-80℃冰箱保存，待后续试验。

1.2.1.4 激素处理 将糜子幼苗同时放入6种植物激素中进行处理（100 μmol/L的脱落酸（ABA），100 μmol/L的茉莉酸甲酯（MeJa），2 mmol/L的水杨酸（SA），50 μmol/L的生长素（IAA），10 mmol/L的过氧化氢（H2O2），10 mg/L的赤霉素（GA）），并以水处理为对照，在 0，1，3，6，9，12，24 h 剪取糜子幼苗的根、茎、叶后迅速用液氮冷冻，并放入-80℃冰箱保存。

1.2.2 植物总RNA提取 植物总RNA提取采用RNA提取试剂盒DP432（天根生化北京科技有限公司），提取后将RNA反转录为cDNA，采用FastKing一步法除去基因组cDNA；第1链合成预混试剂（KR118）购自天根生化北京科技有限公司，具体操作依照说明书进行。

1.2.3 基因克隆 从NCBI中查找出水稻、谷子、玉米、柳枝稷等作物ASR2家族基因，取其中遗传较为稳定的ASR2基因序列来克隆，然后选取与糜子同源关系最相近的柳枝稷ASR2基因EST序列为模板在NCBI里面的primer-blast设计引物，设计完成后用软件Primer 5.0检查该引物的特异性。扩增PmASR2基因共设计了2对引物，分别为1～432 bp长度的正向引物5-′GGCGAGGTCAACTACGAGA A′-3，反向引物 5-′CAGACAGCACCACACGGTTA′-3；117～541 bp长度的正向引物 5-′CTCCCCTGAC AAGTTCGCA′-3，反向引物 5-′TAGCGCACACGAG TTGAAAG′-3，扩增体系为 50 μL，以不同时间各个处理的糜子叶片cDNA等量混合样为模板，模板体积 5 μL（100 ng/μL）cDNA 质量浓度 100 ng/μL，正反引物各 4 μL（10 mmol/L），2×GC-Rich PCR Master Mix 25 μL（KT206购自天根生化北京科技有限公司），加入ddH2O补足50 μL。PCR反应程序为94℃5 min；接着 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共34个循环；然后72℃延伸10 min。PCR结束后取3 μL 产物与 1 μL 6×DNA Loading Buffer混合，在含有1%的琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物检测。检测大小片段准确后，回收并纯化目的条带，连接到克隆载体pGM-Simple-TFast Vector，热激转化感受态细胞DH5α，通过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，经菌液PCR验证为阳性克隆子，后送上海美吉生工测序，测序结果经过拼接后在NCBI数据库中进行Blast N比对。

1.2.4 生物信息学分析 将所得的序列，利用DNAMAN软件进行拼接，利用NCBI数据库CD-search在线分析软件进行保守域预测。利用WoLF PSORT在线软件进行亚细胞定位分析，利用NCBI中BlastP进行蛋白质结构保守域分析，采用ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）软 件 计算该蛋白分子量及等电点，多重比较及系统进化树利用MEGA7.0软件进行分析。

1.2.5 基因表达分析 将所得糜子ASR2的EST序列设计引物，正向引物为5-′TTGCCTGAACCCTG AAGCAT′-3，反向引物为 5-′AACACCGGACCGAA TTCCTG′-3，各 4 μL（10 mmol/L），根据蒋晓梅等[23]报道的柳枝稷RT-PCR内参基因，筛选出在干旱、盐、糖胁迫稳定度较高的ACT2作为糜子内参，引物序列为正向引物5-′GCGAGCTTCCCTGTAGGTA G′-3，反向引物 5-′CGAACCCAGCCTTCACCATAC′-3，RT-PCR反应体系为20 μL，经调整合适的cDNA体积，不超过2μL，正向引物和反向引物均为0.6μL，2×SuperReal Color PreMix 10 μL，RNase-free ddH2O补足至20μL。反应程序为95℃预变性15min；95℃10 s，60℃30 s退火加延伸，40个循环。

2 结果与分析

2.1 糜子ASR2基因的克隆

以糜子的第1链cDNA为模板，同时设计了2对引物，并用其上下游引物进行PCR扩增，将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示，1，2号引物分别扩增得到432，424 bp长度片段（图 1）。

将目的片段进行纯化回收、连接转化、测序获得序列，所得的序列在DNAMAN软件进行拼接获得全长541 bp；将所得的序列在NCBI中rpsblast分析得出，这是一种由缺水胁迫引起的植物ABA/WDS诱导蛋白质（ASR），该序列包含完整的编码区域，命名为 PmASR2（Genebank 登录号：MH937580），该基因cDNA片段保守域长336 bp，共编码112个蛋白质（图2），且经过DNAMAN软件亲水性和疏水性预测，该蛋白为亲水蛋白（图3）。

2.2 生物信息学分析

利用WoLF PSORT在线软件进行基因亚细胞定位预测，结果显示，PmASR2基因定位在细胞核内；用在线网站ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）预测PmASR2所编码的氨基酸序列蛋白质分子量为13 454.92 ku，等电点为11.39，分子式为C581H912N198O172S1，其中，富含谷氨酸和组氨酸等氨基酸。将糜子ASR2氨基酸序列与其他已被发现的含有ASR基因的8种作物（柳枝稷PUZ47142.1、马铃薯 XP_006359804.1、番茄 XP_004237807.1、谷子XP_004952697.1、玉米 XP_008645776.1、高粱 XP_002447825.1、水稻BAD28235.1、短花药野生稻XP_006647355.1）进行多重比较（图4），可以发现，这几个作物的ASR氨基酸序列相似度较高，其中，糜子ASR2基因氨基酸序列与高粱XP_002447825.1最相近，与番茄XP_004237807.1差异最大。

使用NCBI-blast网站上9种植物的cDNA序列，并用MEGA 7.0构建系统发育树，结果显示，其cDNA序列相似度较高，在51.2%～86.4%（图5）。其中，糜子与柳枝稷一致性最高，为86.4%；与番茄一致性最低，为51.2%；与谷子和高粱一致性分别为85.5%和84.0%，而番茄和马铃薯ASR基因一致性为76.4%。

2.3 糜子ASR2的表达分析

2.3.1 在干旱、盐、糖胁迫下PmASR2基因荧光定量分析 由图6-A可知，糜子幼苗在PEG胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎，茎中几乎没有变化。PmASR2基因在根和叶片中相对表达量在6 h达到峰值，根中是对照11.6倍，叶片中是对照的3.7倍。糜子幼苗在NaCl胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎（图6-B），在茎中几乎没有变化，PmASR2基因根和叶片相对表达量在6 h达到峰值，根中是对照16.7倍，叶片中是对照3.6倍。糜子幼苗在甘露醇胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎（图6-C），茎中ASR基因相对表达量几乎没有变化，PmASR2基因根中相对表达量（0～3 h）逐渐上升在（3～24 h）逐渐下降，且在3 h达到峰值是对照7.2倍，叶中相对表达量（0～6 h）逐渐上升在（6～24 h）逐渐下降，且在 6 h达到峰值是对照的5.1倍。这些结果表明PmASR2在非生物胁迫干旱、盐、糖环境下可能发挥着重要的作用，其中在干旱和盐环境中较为明显。

2.3.2 在植物激素胁迫下PmASR2基因荧光定量分析 从图7可以看出，糜子幼苗在ABA激素胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根＞叶片＞茎，茎中ASR基因相对表达量几乎没有变化，PmASR2基因根中和叶片相对表达量均在6 h达到峰值，根中是对照的16.4倍，叶片中是对照的6.8倍；糜子幼苗在GA激素胁迫下PmASR2基因相对表达量均无明显变化；糜子幼苗在H2O2激素胁迫下，PmASR2基因相对表达量的变化情况为根＞叶片＞茎，茎中PmASR2基因相对表达量几乎没有变化，根和叶中PmASR2基因相对表达量均在6 h达到峰值，根是对照的3.9倍，叶片是对照的2.5倍；糜子幼苗在IAA激素胁迫下，PmASR2基因相对表达量的变化情况为根＞叶片＞茎，茎中的PmASR2基因相对表达量几乎没有变化，根中和叶片中PmASR2基因相对表达量均在6 h达到峰值，根是对照的7.0倍，叶片是对照的3.8倍。

糜子幼苗在SA激素胁迫下PmASR2基因相对表达量的变化情况为根＞叶片＞茎，茎中PmASR2基因相对表达量几乎没有变化，根中PmASR2基因相对表达量在3 h保持较高水平，直至24 h达到峰值，是对照的9.8倍；叶中PmASR2基因相对表达量在3 h达到峰值，是对照的6.5倍。糜子幼苗在MeJa激素胁迫下PmASR2基因相对表达量的变化情况为根＞茎＞叶，叶和茎中PmASR2基因相对表达量几乎没有变化，根中PmASR2基因相对表达量0～9 h逐渐上升，在9～24 h逐渐下降，且在9 h达到峰值，是对照的6.6倍。表明PmASR2基因受许多激素诱导，其中，受ABA，IAA，SA激素诱导较为明显。

3 讨论

ASR蛋白是植物中广泛存在的一类主要参与植物胁迫应答的蛋白，当植物遭受逆境（干旱[24]、盐[25-26]、糖[27]及一些植物激素）胁迫时，ASR基因会被诱导，从而减轻逆境对植物细胞引起的伤害。

本研究通过查找糜子近源物种柳枝稷ASR基因cDNA，进行基因克隆及生物信息学分析，我们克隆鉴定了PmASR2基因，其全长541 bp，保守域长336bp，共编码112个氨基酸，该基因包含ABA/WDS保守结构域，对其亲疏水性分析发现，PmASR2为亲水基因，原因可能是由于其蛋白组成富含谷氨酸和组氨酸等亲水性氨基酸，这与张会等[28]在厚藤ASR基因里发现的氨基酸组成相似，猜测糜子ASR基因可能与厚藤ASR基因一样可以响应ABA和非生物胁迫的诱导。通过进化树分析发现，糜子PmASR2基因在禾本科作物遗传过程中还非常保守，这与许灿等[29]在枇杷中的研究结果相似，说明当糜子受到干旱胁迫时能促进该蛋白合成，从而降低干旱对植物的损害。同时，本研究对糜子PmASR2基因在PEG，NaCl和甘露醇胁迫下的转录水平进行了分析，结果表明，该基因在茎和叶中表达量较高，而在根中表达量较低，这与桑树中ASR基因在叶、花、茎中表达量大于根中的研究结果一致[30]，随着时间的延长在 PEG，NaCl，甘露醇处理PmASR2基因的表达均呈现先升高后降低的趋势。并且根中该基因相对表达量峰值始终高于叶片中，说明该基因在感受到逆境胁迫时优先在根中表达。FENG等[31]研究发现，谷子ASR家族在PEG，NaCl，甘露醇胁迫时基因相对表达量在根和叶中有明显的增加，在茎中却开始减少，SiASR3，SiASR4和SiASR6在根中优先表达，说明PmASR2蛋白具有组织特异性和功能特异性。

通过6种植物激素处理发现，随着时间增加，ABA，IAA，MeJa，H2O2处理中糜子 PmASR2 基因呈现先升高后降低的趋势，其中，ABA，IAA，H2O2胁迫6 h达到达峰值，而SA处理3 h就达到较高的转入水平，并一直保持到24 h，说明该基因受许多植物激素诱导。其中，SA，IAA，H2O2，MeJa能够轻微地诱导PmASR基因上调表达，ABA处理下相对表达量变化最为明显，杨晓月等[32]在二穗短柄草中也观察到相似的研究结果，说明渗透胁迫诱导PmASR2基因上调涉及到ABA信号，参与了糜子自身抗逆保护。

本研究通过对糜子PmASR2基因克隆及生物信息学分析、荧光定量表达分析，旨在为进一步研究PmASR2基因生物学功能、明确糜子PmASR2基因对逆境胁迫的调控机制等奠定基础。