毛建草茎段愈伤组织的诱导及继代培养试验

宗 越，郭晓红，田旭平

（山西农业大学林学院，山西太谷030801）

毛建草（Dracocephalum rupestre Hance），又称毛健草，学名岩青兰，唇形科青兰属植物。根茎直，生出多数茎。茎不分枝，叶片三角状卵形，轮伞花序密集，花冠紫蓝色，花期7—9月[1]。全草具香气，可入药，也可代茶饮[2]。因其花颜色是蓝紫色，具有一定的观赏性，在园林绿化中可作花带、花镜、花坛栽培。山西毛建草多为野生资源，野生毛建草基本靠茎的伸长来繁殖。人工栽培主要通过种子繁殖，但种子小且成熟时易脱落，不易采集，所以，毛建草的种子繁殖有一定的局限性。而植物组织培养技术不仅可以避免自然条件带来的限制，还可以在短时间内利用最少的植株材料大规模的实现毛建草的组培苗繁殖[3-5]。

本研究选取毛建草茎段为外植体材料，通过对其愈伤组织诱导及继代培养，筛选出毛建草愈伤组织诱导及建立植株再生体系的最适激素浓度组合，从而为毛建草的研究提供理论及实践依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为毛建草幼嫩的茎段，毛建草均来自于太谷县山西农业大学林业站。

1.2 外植体处理

2018年5月21日在山西农业大学林学院实验室将采摘的毛建草茎段清洗干净后置于流水下冲洗1 h，然后在无菌条件下用75%的酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3～4次，再用1%的升汞浸泡7 min，之后再用无菌水冲洗3～4次。在超净工作台上，用手术刀将毛建草茎段切成1 cm左右的小茎段，用镊子将小茎段接种至培养基，每个培养基中放6个小茎段。

1.3 试验设计

采用MS培养基为基本培养基。愈伤组织诱导培养基配方：6-BA质量浓度分别为0.5，1，2 mg/L，NAA质量浓度分别为0.2，0.5，1 mg/L，共9个处理，5次重复。35 d后观察并统计茎段愈伤组织的诱导情况。继代培养基配方：6-BA质量浓度分别为0.5，1，2 mg/L，NAA 质量浓度分别为 0，0.05，0.1 mg/L，共9个处理，5次重复。20d后观察并统计愈伤组织的继代培养情况。培养基均添加蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L；pH值5.8～6.0，高压灭菌锅灭菌。培养温度25℃左右，光照时间15 h/d，光照强度4 000 lx。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导

7 d后愈伤组织形成，呈浅绿色（图1-A）；15 d后愈伤组织增大，表面覆盖少许白点（图1-B）；25 d后愈伤组织继续增大，呈深绿色（图1-C）；35 d后愈伤组织不再增大，表面呈黄绿色（图1-D）。结果表明，Y1，Y2处理的愈伤组织的诱导率较高，而且Y2处理的愈伤组织的生长状态最好，所以，6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L为诱导毛建草茎段愈伤组织的最适培养基（表1）。

表1 2种激素配比对茎段愈伤组织诱导的影响

2.2 继代培养

选择生长状态良好的愈伤组织转接到以MS培养基为基本培养基，附加6-BA，NAA 2种激素配比的继代培养基上进行增殖培养，发现愈伤组织在9种继代培养基上进一步增殖分化出根，而不是芽（图 2）。

由表2可知，愈伤组织在N2，N3处理中生根率较高，但N2处理中不定根生长较粗壮且数量多，所以，6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L为诱导毛建草愈伤组织不定根的最适培养基。

表2 2种激素配比对愈伤组织继代培养的影响

3 结论与讨论

3.1 愈伤组织的诱导

诱导毛建草愈伤组织的培养基选择6-BA与NAA2种激素的配比组合，结果显示，6-BA与NAA的浓度均较小时，其愈伤组织的诱导率高；6-BA质量浓度高时容易造成毛建草茎段的褐变死亡，导致愈伤组织的诱导率降低。蔡汉权[6]在利用罗勒顶芽和带腋芽茎段进行愈伤组织诱导时发现，6-BA质量浓度为4 mg/L，NAA质量浓度为0.1 mg/L时，罗勒的愈伤组织诱导率最高，达95%；廖苏梅等[7]对薰衣草的种子在6-BA质量浓度为2，4 mg/L时分别进行了愈伤组织的诱导，对比发现6-BA质量浓度高时，外植体的致死率较高，愈伤组织诱导率低；谈永霞[8]利用百里香茎段诱导愈伤组织时发现，6-BA质量浓度为1 mg/L时，该愈伤组织诱导率最高。以上结果说明，唇形科的植物在诱导愈伤组织形成时，6-BA质量浓度相对较小时诱导率高。本试验只对6-BA与NAA这2种生长调节剂进行了筛选，其他生长调节剂的组合有待进一步研究。

其次，愈伤组织的诱导率与外植体的选材部位及采集时间有关系[9-10]。刘艳芬等[11]对大叶蒲公英的叶片进行愈伤组织诱导时发现，含叶脉处比不含叶脉处愈伤组织发生速度快，愈伤组织面积大。刘军等[12]利用美国薄荷的茎段及叶片进行组织培养时发现，美国薄荷的茎段出愈率高于叶片。温琳等[13]对半夏叶柄进行愈伤组织诱导时发现，材料的采集时间与愈伤组织的诱导率有明显关系，出苗期及生长旺盛期材料分生能力较强，珠芽成熟期及倒苗期材料分生能力弱。以上结果说明，外植体的选材部位及采集时间对愈伤组织的诱导有影响。

3.2 继代培养

本试验的继代培养基为芽分化培养基，根据文献记载，当6-BA质量浓度高、NAA质量浓度低时，有利于芽分化。本研究表明，以毛建草茎段为外植体诱导的愈伤组织只分化出了不定根，未分化出丛生芽。茎段愈伤组织未分化出芽的原因可能是外源激素选择不当或者添加浓度有误，也可能与温度、光照等培养条件有关[14]。梁峥等[15]在微型月季丛芽分化试验中研究发现，6-BA质量浓度在0.1～0.5 mg/L时，植株生长缓慢，丛芽分化很少；当6-BA质量浓度达到1 mg/L时，植株生长旺盛，丛生芽分化较多。王政等[16]对非洲菊组培苗进行不同光源处理研究发现，不同光源对组培苗叶片及根的伸长都有显著影响。张海龙等[17]在对冰灯玉露组培苗进行研究发现，光照强度对于组培苗生长速度与形态建成有较大影响。黄冰艳等[18]对甘薯茎尖分生组织进行组织培养时，丛生芽的诱导率在光照时间14 h/d条件下要高于10 h/d。

另外一个原因可能与选材有关，有些植株在一定程度上可能很难经过愈伤组织分化增殖而成为一个完整的植株。器官发生是指植物不同器官直接不定芽及不定根分化进而产生完整植株的过程，包括直接和间接2种途径。前者是外植体直接不定芽及根诱导，后者则需先产生愈伤组织，再不定芽及根诱导[19]。最适宜作为毛建草组织培养及快速繁殖的外植体可能是其带腋芽的茎段，刘俊等[3]利用毛建草带腋芽的茎段建立了毛建草的快繁体系；张树河等[20]利用迷迭香带腋芽的茎段实现了迷迭香的组培快繁技术。以上研究表明，适宜毛建草快繁体系建立的方式可能是器官发生的直接途径。该结论有待进一步进行验证。

本研究表明，毛建草茎段愈伤组织诱导的最适培养基配方为MS＋6-BA0.5 mg/L＋NAA0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋琼脂6.5 g/L，诱导率高达97%；茎段愈伤组织继代培养时更容易生根。植物组织培养可以对植物进行工业化生产，不占用耕地，在完全人工控制的情况下不断进行生产，不受地区、季节、土壤及有害生物的影响。所以，利用组织培养可以实现毛建草的大规模生产。