不同菌种对中华稻蝗抗氧化酶活性的影响

王小莉，张雪娟，张 欣，刘庆华，张小民

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.太原市食品药品检验所，山西太原030006）

昆虫不像哺乳动物那样拥有完善的免疫系统，血淋巴是其参与免疫反应的主要执行者，在抵抗外源物的入侵过程中发挥重要的作用[1-2]。在生物体内，氧化应激是机体进行自我保护的一种方式，因为机体生命活动过程中会伴随自由基的产生与消除，二者之间只有保持动态平衡，才能保证生命活动的正常进行。如果二者之间的平衡被打破，机体将会受到损伤或导致死亡。有研究表明，昆虫体内存在超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等保护酶[3-4]。生物体受到刺激后，将导致机体中抗氧化物酶系的动态平衡被打破，使得自由基的数量增加，从而引起机体的应激反应。SOD是一种以自由基为底物的抗氧化酶，与POD共同作用，清除体内产生的活性氧自由基，保护机体免受伤害[5-6]。张奎花等[5]研究表明，采用异小杆线虫感染菜青虫（Pieris rapae）后，体内SOD活性呈先升高后降低的变化趋势，POD活性呈先降低后升高的变化趋势；靳晓敏等[6]研究表明，采用2种菊酯类农药感染鲤血清后，体内SOD活性呈下降趋势，CAT活性呈先升高后降低的变化趋势。可见，氧化应激在免疫防御过程中也发挥重要作用。

本研究通过给稻蝗（Oxya chinensis）注射枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），并测定不同时间段稻蝗血淋巴中SOD和POD的活性，旨在为进一步研究稻蝗的免疫反应提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试昆虫为中华稻蝗成虫，于2017年9月11日采自山西省太原市晋源区（112°48′E，37°73′N）。

供试枯草芽孢杆菌菌种、金黄色葡萄球菌菌种由山西大学微生物实验室提供；昆虫超氧化物歧化酶酶联免疫分析试剂盒、昆虫过氧化物酶酶联免疫分析试剂盒均购于上海酶联生物科技有限公司。采用酶标仪进行测定。

1.2 方法

1.2.1 饲养方法 将从田间采回的稻蝗成虫放置在90 cm×60 cm×60 cm的养虫笼内，喂食新鲜的狗尾巴草，每天换草1～2次；饲养期间每隔4 h在笼外洒水以保持湿度，持续饲养7 d。

1.2.2 菌液的配制 取LB琼脂斜面培养48 h的枯草芽孢杆菌一支和LB琼脂斜面培养72 h的金黄色葡萄球菌一支，每种菌均用10 mL的无菌水分2次将斜面菌苔完全洗下，分别倒入含有玻璃珠的三角瓶中，做好标签，充分振荡，使菌落分散。吸取配好的菌液置于血球计数板计数，若浓度过高，则稀释至菌液浓度大致为1×105个/mL。

1.2.3 供试虫处理 试验当天，7：00给饲养7 d的稻蝗成虫分别注射1×105个/mL枯草芽孢杆菌菌液和金黄色葡萄球菌菌液，每只稻蝗注射20 μL，每种菌液注射100只，注射完依次放置在相应的30 cm×30 cm×30 cm的养虫笼内，做好标签；再取30只稻蝗放置在另一个笼中作为空白对照。在注射 4，8，12，24，48 h 时取血，将所取稻蝗的血淋巴放入PC管中，贴上标签，放置在-80℃的冰箱中备用。

1.2.4 血淋巴中SOD和POD的酶活性测定 利用试剂盒测定血淋巴中SOD和POD的酶活性。

1.3 数据统计

试验数据采用SPSS 22.0统计软件进行差异显著性分析。采用单因素方差分析法分析试验组与空白对照组间的差异显著性（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 感染菌后稻蝗血细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化

由图1可知，试验组SOD活性整体高于对照组，SOD活性随注射菌液后时间的延长呈先升高后降低的变化趋势，其中，枯草芽孢杆菌组在12 h时活性达到最高，金黄色葡萄球菌组在8 h时活性达到最高。与空白对照组相比，枯草芽孢杆菌组在8，12，24 h 时表现出明显的差异性（P＜0.05），金黄色葡萄球菌组在8 h时表现出明显的差异性（P＜0.05），其他时间段试验组的SOD活性均与对照组间无明显的差异性（P＞0.05）。

2.2 感染菌后稻蝗血细胞中过氧化物酶（POD）活性的变化

由图2可知，试验组POD活性均高于对照组，活性变化不稳定。与空白对照组相比，枯草芽孢杆菌组在8，24，48 h时POD活性表现出显著性差异（P＜0.05）；金黄色葡萄球菌组POD活性在4，24，48 h时表现出显著性差异（P＜0.05），其余时间段与对照组相比均无明显差异（P＞0.05）。

3 结论与讨论

超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶是氧化应激保护酶系统中重要的成分[9]。正常情况下，以上3种酶协调一致参与细胞内自由基的产生和消除，使生物体的自由基维持在一个相对稳定的状态，保证生命活动的正常进行[10-11]。若自由基的清除功能出现异常，会使机体受到自由基的损伤[8]。受到异物刺激后，昆虫体内自由基的清除将出现故障，自由基增多，使昆虫生化反应和生理功能紊乱，机体出现病理性变化。因而，研究昆虫的抗氧化酶系具有重要的意义。当机体中自由基数量增加时，SOD催化O2-转化为H2O2，再由CAT或POD将H2O2分解成H2O和O2，这样有毒性的自由基会转化成无毒的H2O和O2，从而达到清除自由基的目的[12-17]。姬国红等[18]研究线虫感染菜青虫（Pieris rapae）后体内SOD和POD活性呈现先升高后降低的趋势。张珏锋等[19]研究表明，绿僵菌感染褐飞虱后，褐飞虱体内的SOD活性和POD活性均显著升高。李嘉丰等[20]研究表明，黑斑病侵染五味子后，导致五味子体内的SOD和POD酶活性显著提高。

本研究中，稻蝗感染菌种后其血细胞中SOD活性呈现先增加后降低的趋势，原因可能是由于菌种对稻蝗血细胞造成伤害，导致血细胞中自由基数量增加，从而使血细胞中SOD活性增加，用于清除菌种对稻蝗血细胞的氧化损伤；稻蝗感染菌种后POD活性变化不稳定，POD主要用于清除SOD作用过程中产生的H2O2，使自由基变成无毒害作用的H2O和O2。综合2种酶活性可知，2种菌均可引起血细胞抗氧化酶活性的变化，其中，枯草芽孢杆菌对稻蝗血细胞抗氧化酶的活性影响较大。受到菌种感染后，稻蝗血细胞产生一系列的应激反应，其迅速启动血细胞中SOD和POD清除自由基，消除自由基对机体的毒害，维持机体正常的生命活动。菌种感染稻蝗后，稻蝗血细胞中SOD和POD活性均高于对照组，可见，稻蝗血细胞可以通过提高酶活性来抵御菌种的毒害作用，这可为研究稻蝗的免疫反应提供试验依据。