叶片直接PCR法在玉米转基因快速检测中的应用

赵冰兵 ，任 雯 ，周秒依 ，李韩帅 ，刘 亚 ，白琪林

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031；3.北京市农林科学院玉米研究中心，北京100097）

玉米是全球第一大作物，是粮食、饲料、能源化工等行业的重要作物，其产量直接关系到国家的粮食安全[1]。1996年，转基因玉米首次获得商业化许可进行推广，此后转基因玉米商业化种植面积逐年上升，到2017年，转基因玉米的种植面积达到5 970万hm2，仅次于转基因大豆（9 410万hm2）。随着转基因玉米占转基因农作物比例不断攀升，玉米转基因品种的数量也越来越多[2]。而玉米转基因检测作为转基因研究体系中的重要一环，其重要性不言而喻。转基因玉米成分检测对于鉴定转基因玉米品种、对转基因产品进行有效规范管理具有重要的现实意义[3]。

随着转基因技术的迅速发展，其配套的转基因检测技术也层出不穷，除了应用最为普遍的常规PCR方法，根据PCR原理技术又发展出一系列诸如多重PCR、复合PCR、数字PCR以及RT-PCK等转基因检测手段[4-10]。而在玉米转基因检测过程中使用最为普遍的常规PCR法检测中使用CTAB法、SDS法等方法[11-12]提取制备DNA模板不仅是检测的第1步，也是检测中耗时耗力最多的一个环节。直接PCR技术的出现无疑是解决这一问题的一大突破。张晋强等[13]利用血液直接PCR法，建立了一种快速检测猪嗜血支原体感染的方法；罗天宽等[14]采用水稻不同类型叶片作为PCR扩增模板，直接进行PCR反应，成功建立一种适用于水稻叶片检测的直接PCR法；陆绍红等[15]通过直接PCR法对血液中伊氏锥虫感染进行了检测，使该方法可以应用于伊氏锥虫病的早期诊断以及现场调查；闵现华等[16]研究证明，直接PCR法可以作为一种高特异性、高灵敏度、简便快捷的方法用于检测番茄种子携带的番茄溃疡病菌；邢珍娟等[17-18]以转CP4-epsps基因玉米为材料，对直接PCR快速检测方法在玉米检测中的应用进行了初步探索，而该直接PCR方法在其他玉米转基因成分检测中的应用并不多见。

本研究以CC-2和2A-5这2种转基因玉米样品的叶片作为PCR反应模板，进行直接PCR反应，建立适用于玉米中转基因成分检测的直接PCR方法，并结合多重PCR技术，获得一套检测结果特异性高的直接PCR技术体系，用于快速筛查转基因玉米。

1 材料和方法

1.1 试验材料

转基因样品材料为CC-2和2A-5；非转基因样品材料为京科968（对照）。

1.2 试验试剂

Phire热启动II DNA聚合酶及dNTPs，购自Thermo公司；DNA分子量标记（100 bp DNA Marker），购自北京全式金生物科技公司。

1.3 引物设计

利用引物设计软件Primer 5.0分别对CC-2和2A-5设计若干对事件特异性引物，根据玉米基因组序列及结构对设计的多对引物进行筛选及优化，并参考中华人民共和国农业部关于转基因玉米检测的相关法律法规[19]，最终确定一对用于本试验的检测引物（表1）。本试验采用了叶绿体DNA中的高度保守基因IRB18基因设计引物作为对照引物[20]。试验中所用引物均由北京擎科新业生物公司合成，引物终浓度为10 μmol/L。

表1 转基因玉米检测引物

1.4 试验材料的准备

从2种转基因玉米材料CC-2，2A-5及非转基因玉米材料京科968中挑选籽粒饱满、无损伤的种子，分别于培养箱内浸泡6 h，30℃暗条件下进行发芽。48h后挑选发芽整齐一致的种子播种在23cm×16 cm规格的塑料盆内。每盆播4粒种子。每个塑料盆内填充1.8 kg壤土、0.7 kg蛭石（1∶1（V/V））及3.0 g的复合肥（有效含量45%）。

用打孔器于每个样品植株幼苗叶片上取直径为0.5 mm的叶片小块备用；用取下的同一叶片其他部分进行DNA提取（使用收集柱试剂盒提取方法）。同时使用常规提取DNA模板进行PCR检测试验，作为同组样品叶片直接PCR试验的阳性对照。

1.5 PCR反应体系及条件

单重PCR反应体系总体积为20 μL：10 mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，200 μmol/L dNTP each，正反向引物各 0.5 μL，1 U Phire热启动II DNA聚合酶0.4 μL，各成分配置完成后，以ddH2O补齐至20 μL体系。将切割好的0.5 mm的叶片小块直接置于反应体系中，最好使叶片悬浮在反应体系中，叶片贴壁则会影响PCR反应结果。

单重PCR反应条件为：98℃预变性5 min；98℃变性5 s，62℃退火 5 s，72℃延长20 s，40个循环；72℃过度延伸1 min。

多重PCR反应体系使用降落PCR方法，用以提高产物特异性。PCR反应体系总体积为25 μL：10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP each，2 种检测正反向引物各 0.5 μL，1 U Phire热启动 II DNA聚合酶 0.6 μL，2%DMSO，去离子水补充到25 μL。将切割好的0.5 mm的叶片小块直接置于反应体系中。

多重PCR反应条件为：98℃预变性5 min；98℃ 变性5 s，65℃ 退火5 s，每循环降低1℃，72℃延长20 s，20个循环；72℃过度延伸1 min；98℃变性5 s，52℃退火 5 s，72℃延长20 s，20个循环；72℃过度延伸1 min。

1.6 PCR扩增产物

取PCR扩增产物各6 μL进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2%，电泳电压100 V，电泳时间45 min；电泳结束后用凝胶成像系统对结果进行拍照分析。

2 结果与分析

2.1 叶片直接PCR的对照反应

所有材料的叶片样品都经过叶绿体DNA基因IRB18检测，均可扩增出长度为297 bp的特异性条带，与IRB18基因条带预期大小一致（图1），且与使用传统提取DNA模板进行PCR检测的结果对比结果一致。表明此批样品叶片可通过直接PCR方法进行转基因检测。

2.2 转基因玉米事件特异性检测

由琼脂糖电泳结果（图2～4）可知，CC-2，2A-5这2种转基因材料的叶片通过直接PCR方法均扩增出与预期条带大小一致的目的条带，且目的条带的特异性符合试验要求（CC-2为292 bp，2A-5为214 bp）。

2.3 多重PCR检测结果

琼脂糖凝胶结果显示，CC-2和2A-5这2种转基因事件在一次直接叶片PCR反应中得到了有效扩增（图4）。由图4可知，叶片直接PCR进行多重PCR检测效果与常规DNA提取方法效果完全一致。使用待测样品叶片进行直接PCR方法检测，特异性强，具有可重复性，可以作为PCR检测转基因的新方法得到广泛应用。

3 讨论

随着全球越来越多的转基因植物商业化生产应用，对转基因检测工作提出了更高的要求。因此，一种简单、快速、高效的检测方法对于检测工作至关重要，也必然是转基因检测技术的发展趋势。提取DNA耗时耗力，通常提取DNA的步骤所用时间是制约检测效率和速度的主要环节，本研究通过对国内外转基因玉米检测方面现有方法的大量试验和比对，选择IRB18基因作为对照参考基因，将2种转基因玉米事件分别进行PCR事件特异性检测，建立了一套针对叶片PCR的玉米转基因事件检测反应体系和条件，现利用该方法检测转基因事件样品及对照样品均可扩增出符合IRB18基因大小的目的条带，分别单独检测CC-2及2A-5的电泳图中目的条带清晰、特异性强，与国家标准检测条带大小一致。表明该方法可实际应用于转基因玉米检测。

目前，随着转基因技术的发展、转基因作物种类的增加，含有不同转基因成分的混合样品也在不断增加，这就为转基因检测提出了更高的要求。为了进一步提高检测效率，使用本试验中建立的叶片PCR方法进行了多重PCR试验，进一步验证该检测方法的有效性及高效性。由试验结果可以观测到，所选的2种转基因玉米使用叶片直接PCR与多重PCR均获得较为满意的检测结果，扩增条带大小与预期一致，并且条带清晰，特异性高，其中，多重PCR相较于普通PCR来说，具有更高的可靠性与更广的适应性，能够进一步简化检测流程，极大地提高检测效率。

本研究可为转基因玉米PCR检测提供一个新的思路和参考。目前，很多实验室及检测相关部门常用的检测方法是将需要检测的样品种子先进行萌发，然后取幼苗部分作材料进行DNA提取，最后用样品DNA进行PCR扩增，获得检测结果，而这一系列过程花费的时间较长，应用本研究方法在一个较短的时间内即可获得检测结果，将大大地缩短检测周期，提高检测效率。使用多重降落PCR方法有助于更好地提高特异性。试验证明，适当的PCR循环数有利于反应的顺利进行，获得不错的PCR结果。试验中还发现，进行40～45个循环获得的扩增结果令人满意。

但该方法在实际应用中还存在一些问题。老叶片及冻干叶片进行直接PCR效率不高，且条带特异性不强。因此，目前该检测方法仍需使用嫩叶片。此外，某些基因的转化材料尚未找到可以进行直接PCR的引物。这些问题使该方法目前尚不能广泛应用于大批量检测及未知样品检测，仍需继续进行大量的研究工作对该方法的操作及使用进行补充、改进和完善，使其在转基因玉米检测中发挥更大的作用。