上海市定点监测猪群伪狂犬病病原学调查与病毒分离鉴定

鞠厚斌，杨德全，葛菲菲，刘 健，李 鑫，杨显超，齐新永，邓 波，王 建，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科中的伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性多种动物共患传染病[1]。本病在世界范围内普遍流行，目前已有50多个国家和地区报道发生PR。随着规模化养猪业的不断发展和强毒株的出现，PR 的发生和流行日趋严重，给养猪业造成严重经济损失，已成为对全球养猪业危害最大的传染病之一。

从国内流行范围上看，PR流行范围很广，遍及 24 个省（自治区、直辖市），特别是随着养猪业集约化、规模化发展，本病有逐渐扩大和蔓延的趋势，但没有发生大规模暴发，多呈散发流行。从发病年龄上看，以繁殖母猪和仔猪为主，2 周龄以内仔猪的发病率和死亡可高达100%，断奶仔猪的发病率为20%～40%，死亡率为10%～20%，养猪密集地区的发病率较高[2]。2012 年以来，PRV变异毒株在全国范围内流行，给PR净化和预防带来了新的压力，也给我国养猪业造成了惨重损失[3]。为了解上海市定点监测猪群的PRV感染情况，应用荧光PCR方法开展病原学调查，并分离鉴定地方流行毒株，以期为制订合理的PR防控与净化策略提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2014—2015年，采集上海市1个兽医疾病诊断中心、14个种猪场、8个规模猪场、3个屠宰场定点监测猪群的内脏、扁桃体、颌下淋巴结、血清、唾液、精液等样品，共1 863份（表1）。不同种类样品来源于不同猪只，采集后-20 ℃备用。

1.2 实验动物

PRV抗体阴性的6月龄健康家兔6只：购自上海丙干宠物有限公司。

1.3 主要试剂

核酸提取试剂盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit ：购自QIAGEN 公司；PRV荧光PCR试剂盒：购自北京生科尚仪生物科技有限公司；BHK-21细胞株：上海市动物疫病预防控制中心保存；DMEM和胎牛血清：购于Thermo公司。

表1 2014—2015年上海市定点监测猪群PR病原学检测的样品来源与数量

1.4 核酸提取及荧光PCR 检测

参照核酸提取试剂盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit说明提取病毒核酸，按照北京生科尚仪生物科技有限公司的PRV荧光PCR试剂盒说明书进行核酸检测。

1.5 病毒分离与鉴定

1.5.1 病料处理 将无菌采集的病死猪淋巴结、脾脏等组织研磨，用PBS制成1∶10的组织悬液，加入适量青霉素、链霉素处理后，反复冻融3次，4 000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存备用。

1.5.2 病毒的细胞培养 将病料悬液上清液接种于BHK-21单层细胞，盲传3代，观察有无细胞病变。待细胞病变达80%左右时收获病毒液，经3 次反复冻融，4 000 r/min离心10 min，取上清液接种细胞进行病毒克隆纯化及病毒蚀斑计算。

1.5.3 荧光PCR方法鉴定 按照北京生科尚仪生物科技有限公司的PRV荧光PCR试剂盒说明书进行检测。

1.5.4 间接免疫荧光抗体试验（IFA） 将2 mL BHK-21细胞悬浮液加入腔式载玻片，37 ℃温箱培养24 h；弃掉原细胞培养液，用无菌PBS洗3次，再加入1 mL PCR检测阳性的病毒液； 37 ℃温箱作用1 h后，吸掉病毒液，加入细胞维持液继续培养24 h；弃掉维持液，再用PBS洗3次，然后用预冷丙酮固定腔式载玻片上的细胞培养物；用PBS洗涤3次，加入500 µL 1∶100稀释的PRV单抗，37 ℃孵育1 h；用PBS洗涤3次后，同FITC标记的兔抗鼠IgG抗体37 ℃孵育30 min；最后用PBS洗涤3次，在荧光显微镜下观察。同时设置加入PBS的细胞培养物作阴性对照。

1.5.5 毒价测定 取5、10、15、20代病毒培养物，经10倍系列稀释，取100 μL接种到96 孔细胞培养板；每个稀释度设4个孔，观察细胞病变产生情况，按照Reed-Muench 法计算半数细胞感染量（TCID50）[4]。

1.5.6 家兔接种试验 将6只实验家兔随机分为2组（试验组4只、对照组2只）；将分离的病毒稀释至103.0TCID50/0.1 mL，然后接种于实验组家兔后颈部皮下，接种剂量为0.2 mL/只，对照组同部位注射生理盐水，观察家兔接种后的临床症状。

2 结果与分析

2.1 病原学检测

2014年共检出39份PRV核酸阳性，总阳性率为4.3%（39/898），分离出10株PRV毒株；2015年共检出9份PRV核酸阳性，总阳性率为0.9%（9/965），共分离出2株PRV毒株。从检测结果（表2）可以看出，PRV核酸阳性检出率呈现大幅下降趋势。

表2 2014—2015年PR病原学检测结果

2.2 病毒分离鉴定

2.2.1 病毒细胞培养及荧光PCR鉴定 细胞接毒后12～48 h，出现细胞病变：细胞单层出现双折光性细胞，并逐渐增多，然后完全脱落，形成合胞体，其形态和大小各异（图1）。PRV荧光PCR试剂盒检测结果显示，2014年分离的10株和2015年分离的2株病毒呈典型的S型扩增曲线，证实为PRV。

2.2.2 病毒蚀斑计算 经过3 次筛选，在稀释倍数为10-6的细胞单层上可见较小的单个空斑；4个孔的空斑个数分别为5、3、4、6，共18 个。挑取单个空斑继续在BHK-21 细胞上传代，发现出现典型细胞病变的时间稳定在接种后16 h 左右（图2）。按沈强等[3]的方法计算0.1 mL 的空斑形成单位（PFU）为4.0×10-5。

图1 BHK-21细胞病变

图2 病毒蚀班

2.2.3 BHK-21细胞间接免疫荧光抗体（IFA）鉴定 病料接种BHK-21细胞的IFA检测结果显示，细胞胞浆和胞核呈现明显的特异荧光（图3-A），证明病毒液接种细胞能与PRV单抗特异性结合，表明所分离的毒株为PRV，而未接种的BHK-21细胞未见绿色荧光（图3-B）。

图3 BHK-21细胞间接免疫荧光抗体（IFA）鉴定结果

2.2.4 病毒毒价测定 将分离到的1株病毒接种到BHK-21细胞，连续传代培养20 代，每隔5 代取样测定病毒滴度，发现滴度分别为10-4.8、10-5.0、10-5.3、10-5.6TCID50/0.1 mL，表明病毒分离初期毒价较低，经细胞传代，毒价有所提高，至第20 代，病毒滴度稳定在10-5.6TCID50/0.1 mL。

2.2.5 家兔接种试验 4只家兔接种病料稀释液24 h后，表现精神沉郁、发热、呼吸加快，并出现局部奇痒症状，用力撕咬接种点，引起局部脱毛、皮肤破损出血，严重者出现角弓反张，4～6 h后衰竭而亡（图5）。对照组家兔不表现临床症状。

3 讨论

图5 家兔接种试验

2014—2015年，上海市定点监测猪群中共检出48份PRV核酸阳性，总阳性率为2.6%（48/1 863），2015年的PRV核酸阳性率较2014年大幅下降。从本中心实验室2006年以来的检测数据看，2009年后PR在本市定点监测猪群中病原学阳性率直线上升，至2013年达到31.1%，2014年以后阳性率快速回落，2015年达到最低水平。分析其原因：一是前两年PRV变异株的流行对大多数养殖场造成了很大损失，养殖场普遍加强了PR免疫，对该病的防控意识进一步加强；二是上海市自2015年开始，开展了大规模的退养和整治措施，取缔了周边所有散养户和大部分中小规模养猪场，只保留了大型规模场和种猪场。

2014—2015年诊断中心检出29份PRV核酸阳性样品，占比60.42%（29/48），分析其原因可能与诊断中心的样品主要来源于病死猪有关。2015年的4份内脏阳性样品分别来源于4个规模猪场。经调查，这4家规模猪场未从2014年精液阳性种猪场引进猪只，不存在流行病学关联。上述情况表明，这4家规模猪场可能存在PRV野毒感染。

2014年检出的39份PRV核酸阳性样品中，有15份来自种公猪精液，2015年采集的78份精液中未检出PRV核酸阳性，表明种猪场通过加强PR净化和淘汰阳性种猪取得了良好的防控效果。携带PRV的种公猪基本不表现临床症状，但可通过引种和人工授精方式将疫病传给生产母猪，导致母猪发生流产、难产等繁殖障碍症状，会给养殖场带来严重的疫情威胁和经济损失[5]。因此，及时淘汰阳性种公猪显得尤为重要。通过检测，及时督促种猪场淘汰隐性带毒种公猪，是做好种公猪PR净化的关键，也可为种猪场PR净化方案的制定提供依据。

将采集的样品处理后接种BHK-21细胞增殖，通过观察特异性细胞病变，以及荧光PCR、IFA及动物接种试验，共分离鉴定出12株流行毒株，并对其中1株毒株进行了病毒毒价测定，获得了稳定的毒价，这为进行下一步的动物试验奠定了良好的基础。