云南省昆明市动物园大肠杆菌分离株毒力基因分布特征

谭 珊，宋欣媛，张明通，吴培福

（西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224）

野生动物是一种宝贵的生物资源，在保持生物多样性与生态平衡中处于重要地位，对人类社会的持续发展有重要价值。动物园是饲养野生动物的重要场所，同样也流行一些动物疾病，其中大肠杆菌病较为普遍。致病性大肠杆菌能引起动物严重腹泻、蜂窝织炎、肿头综合征、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、脐带炎、眼炎、纤维蛋白性心包炎和败血症等[1]，给动物健康造成了严重影响。大肠杆菌的致病性由多种毒力因子共同决定。在大肠杆菌侵袭宿主组织并引起发病的过程中，这些毒力因子相互协调，共同发挥作用，帮助微生物逃避或破坏宿主防御机制，进而引发对宿主有害的炎症[2]。因此，开展野生动物疾病防治研究，可以为保护野生动物和人类自身健康提供技术保障。本研究以昆明市圆通山动物园内37种不同动物源粪样中分离鉴定的大肠杆菌为研究对象，分析分离株毒力基因的流行病学特征，以期为动物园动物大肠杆菌病治疗和防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018年3月，在圆通山动物园，随机无菌采集37种动物粪便样品各3份（表1）。

1.2 培养基制备

麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、三糖铁培养基、LB液体培养基等：均购于云南凌普生物科技有限公司，按常规方法配制。

1.3 细菌分离

挑取0.1 g粪样于2 mL离心管中作105倍稀释，将得到的样品稀释液，运用平板划线法，通过伊红美蓝培养基（EMB）、麦康凯培养基、LB固体培养基培养观察，初步筛选大肠杆菌。

1.4 细菌生化试验

根据《肠科细菌生化鉴定编码册》进行生化鉴定，包括糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、明胶液化试验、硫化氢试验等。

表1 采集样品的动物园动物种类

1.5 PCR鉴定

根据GenBank中大肠杆菌的ECO和Uid基因序列[3]，设计合成2对引物，序列见表2。

表2 大肠杆菌鉴定引物

1.6 毒力基因扩增

根据GenBank中已发表的大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）毒力因子调查与分析[4]，将毒力引子划分为：粘附素类基因（fimA、fimH、papA、papC、sfa等），铁获得系统类基因（irp-2、fyuA、iucA、iucD、iutA、iroN等），温度敏感血凝素（tsh），血清抗性蛋白（iss），肠细胞脱落位点毒力岛（eaeA），毒素（vat、stx2f、astA），大肠杆菌素V（colv、colBM），溶血素（hlyE），外膜蛋白（traT），保护素（kpsmT-K1、kpsmT II）， 侵 袭 素（ibeA）。 采 用 Primer-Blast设计引物并计算理论退火温度。引物由铂尚生物技术（上海）有限公司合成，引物序列设计见表3。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌分离与生化鉴定

从37种动物粪样中，共分离纯化出37株大肠杆菌。通过伊红美蓝培养基（EMB）、麦康凯培养基、LB固体培养基培养特性观察，在伊红美蓝培养基（EMB）上，菌落中心呈深紫或无明显暗色中心，菌落呈圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有绿色金属光泽；在麦康凯培养基上，菌落为鲜桃红或微红色，中心为深桃红色，菌落呈圆形、扁平，边缘整齐，表面光滑、湿润；革兰染色均为阴性。生化鉴定结果符合大肠杆菌特性（表4）。

表4 大肠杆菌生化鉴定结果

2.2 PCR检测

扩增的ECO和Uid目的条带大小分别为232 bp和293 bp，与预期目的片段大小一致（图5、图6），表明分离菌均为阳性。PCR检测与生化鉴定结果相符，确定分离的病原菌为大肠杆菌。

表3 毒力基因PCR引物

图5 ECO基因片段电泳结果

图6 Uid基因片段电泳结果

2.3 毒力基因分布

2.3.1 毒力基因检测 对分离鉴定出的37株大肠杆菌，利用19对毒力基因引物进行PCR扩增。结果显示：37株菌的ompA基因检测全部为阳性，ibeA、neuC、iutA、traT、stx检测全部为阴性；35株细菌（94.59%）检出iroN阳性，31株（83.78%）检出 fimC阳性，26株（70.27%）检出aatA阳性，19株（51.35%）检出vat阳性，13株（35.14%）检出fyuA阳性，6株（16.22%）检出tsh阳性，其他基因的检测结果见表5。

2.3.2 同时携带毒力基因数量分布 运用PCR方法对37株大肠杆菌分离株的ompA等19种毒力基因进行检测，并计算19种毒力基因的共携带率。结果显示：同时携带大于或等于10个毒力基因的大肠杆菌有3株（8.10%），携带5～8个的有22株（59.46%），携带5个以下的有12株（32.43%），具体结果见表6。此次检测的19个毒力基因中，强毒力岛基因分别是tsh、iroN、fyuA、iucD、irp2、traT、iss 7种。在37个分离株中，同时携带6种强毒力岛基因的有3株，携带3～4种的有6株，携带2种的有9株，只携带1种的有18株，只有豪猪粪样中分离的1株菌株没有携带强毒力岛基因。强毒力岛基因中，iroN的检出率最高，为94.59%，traT未检出，其余的依次为fyuA（35.14%）、iucD（24.32%）、irp2（18.92%）、iss（18.92%）、tsh（16.22%）。

表5 19种毒力基因检出率情况

2.3.3 毒力基因的动物种间分布 对37种动物粪样分离提取的大肠杆菌携带毒力基因情况进行分析发现，棕树凤头鹦鹉中分离的大肠杆菌携带的毒力基因数最多（12个），其次是赤猴（11个）、马来熊（10个），最少的是老虎（2个），其余动物中大肠杆菌的携带情况见表7。

表6 同时携带毒力基因数量分布

表7 不同动物源大肠杆菌毒力因子携带情况

3 讨论

细菌毒力的强弱很大程度上取决于其所携带的毒力因子（VFs）[5]。目前，致病性大肠杆菌的毒力因子主要划分为黏附素（ fim、ompA）、温度敏感血凝素（tsh、iutA）、摄铁系统（耶尔森强毒力岛基因irp2、fyuA）、侵袭因子（ibeA）、血清抗性蛋白（iss）、毒素和大肠杆菌素。

本研究对37株不同动物源粪样大肠杆菌分离株进行19种毒力基因检测，发现检出率相对较高的依次为ompA（100%）、iroN（94.59%）、 fimC（83.78%）、aatA（70.27%）、vat（51.35%），其他的均在35.14%以下。由此可以看出，ompA、iroN、 fimC基因在圆通山动物园的致病性大肠杆菌中最为常见。 fimC、kspM、papC是菌毛蛋白基因，aatA是转运蛋白，tsh、iroN、fyuA、iucD、irp2、traT、iss 7种基因属于强毒力岛基因[6]。7种强毒力岛基因中有6种在分离株中被检测出来，其中iroN的携带率最高，为95.49%，其余5种的携带率也较高，说明动物园动物携带了不同致病性的大肠杆菌。

研究发现，动物大肠杆菌病的致病力与其携带的毒力因子种类及数量密切相关，涉及的基因主要有 iutA、tsh、iroN、cvaC、astA、iss、irp2、papC、iucD、vat等。董向磊[7]研究认为，在iutA、iss、tsh、iroN、irp2、cvaC 6种毒力基因中，如果APEC分离株同时携带有2种以上毒力基因，则有89.74%的概率认定该分离株具有致病性，误差率为7.90%。

根据不同动物大肠杆菌毒力基因携带情况，结合相关研究推断，动物园动物中，棕树凤头鹦鹉、赤猴、马来熊、麋鹿、绯胸鹦鹉、野猪等携带的毒力基因数量最多，由大肠杆菌致病的风险较高，豪猪、老虎、耳廓狐、环尾狐猴、灰叶猴、黑毛仙猴、黑叶猴等相对较低。导致这个结果的原因可能与它们的生活环境有关。生活环境较为密闭的动物，如老虎、耳廓狐、环尾狐猴、灰叶猴、黑毛仙猴、黑叶猴等动物体内的大肠杆菌携带的毒力基因种类较少，而生活环境与外界接触较大的动物，如赤猴、马来熊、麋鹿等体内的大肠杆菌携带的毒力基因种类较多，更容易患病。也有可能与动物自身的适应能力和抵抗力有关。有些动物比较适应昆明市的气候条件，抵抗力更强，患病率低，而有些动物不能适应昆明市的气候条件或者抵抗力太差，则患病率高，需要改善饲养条件，加强饲养管理，提高其抵抗力。

4 结论

本研究从圆通山动物园37个动物种群粪便中分离鉴定出37株大肠杆菌，并对19种毒力基因的携带情况进行了检测，发现昆明市圆通山动物园内流行的大肠杆菌以致病菌为主，不同种类动物体内大肠杆菌的毒力基因携带率存在较大差异，其原因可能与动物的饲养环境以及动物自身的适应能力和抵抗力有关。因此，对于棕树凤头鹦鹉、赤猴、马来熊、麋鹿、绯胸鹦鹉、野猪等具有较高大肠杆菌致病风险的动物，要采取相应防治措施，加强预防和控制，防止大肠杆菌病发生与流行。