鉴别H7N9流感病毒强毒和弱毒实时荧光RT-PCR方法的建立

蒋文明，李 阳，李金平，袁丽萍，侯广宇，程善菊，刘华雷

（中国动物卫生与流行病学中心，国家禽流感专业实验室，山东青岛 266032）

2013年我国在人群病例和家禽中检测到H7N9流感病毒。虽然动物攻毒试验证明，从家禽中分离到的H7N9流感病毒对家禽无致病力，但还是给家禽业造成了巨大经济损失[1]。随着H7N9流感病毒的演变，在经历了3年多时间之后，2016年底，H7N9流感病毒从弱毒株变异为强毒株，并开始在多地引发了家禽高致病性H7N9流感疫情。

当前，各地家禽的H7N9流感疫情仍时有发生。对H7N9流感及早做出诊断是做好该病防控和切实保障养禽业健康发展的重要内容，因此建立H7N9流感病毒快速检测方法十分必要。前期，本实验室建立了一种能同时鉴别H7亚型和N9亚型流感病毒的双重RT-PCR方法[2]，以及一种H7亚型流感病毒通用及区分强弱毒株的RT-PCR方法[3]。这些普通RT-PCR方法检测时间较长，需要电泳等开放的环节程序，容易对周围环境造成核酸污染。而其他方法，如病毒分离、动物试验等方法，耗时更长、要求更高。本研究建立了一种可以区分H7亚型流感病毒强弱毒株的实时荧光RT-PCR方法。该方法检测需时短，仅需1台荧光PCR仪即可在密闭反应管中快速完成，且在检测过程中可实时查看反应曲线，快速做出结果判断，对疾病的快速诊断具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病毒

H7N9、H5N6、H9N2等亚型流感病毒，以及新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒：均由本实验室分离保存。

1.2 主要试剂盒

QIAamp Viral RNA Mini Kit：购自 Qiagen 公司；HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit：购自Vazyme公司；TOPO载体克隆试剂盒：购自Clone Smarter公司；禽流感（AIV-H7）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒：购自深圳匹基生物工程股份有限公司（批号20171102）；禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒：购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司（批号AIVH7 20180703P）。

1.3 引物设计

根据GenBank和GISAID数据库中发表的序列以及本实验室分离毒株序列，比较H7亚型高致病性毒株和低致病性毒株HA核苷酸序列（主要差异在HA裂解位点处），在保守区设计1对引物，在HA裂解位点处设计2条探针（专利申请中，待公开）。探针5'端分别标记FAM和Cy5，3'端分别标记BHQ1和BHQ2。

1.4 单重实时荧光RT-PCR方法的建立

根据QIAamp Viral RNA Mini Kit操作说明，提取H7N9流感强毒株和弱毒株的RNA。在反应体系中依次加入 2×qRT-PCR Buffer 25.0 μL、水 6.5 μL，引物、探针各 2.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 2.5 μL，最后加入 RNA 模板 10 μL。RT-PCR反应条件为：50 ℃ 10 min，95 ℃ 2 min，然后进行40个循环（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，收集荧光信号）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，产物经胶回收后连接TOPO载体进行测序。

1.5 实时荧光RT-PCR鉴别方法的建立及优化

在反应体系中依次加入2×qRT-PCR Buffer 25.0 μL、水4.5 μL，引物、探针各2.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 2.5 μL，最后加入H7N9流感强毒株或弱毒株RNA模板10 μL。RT-PCR反应条件为：50 ℃ 10 min，95 ℃ 2 min，然后进行40个循环（95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，收集荧光信号）。

对反应体系中的不同引物、探针浓度组合（引物 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μmol/L， 探 针 1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μmol/L）和扩增时反应参数（反转录5、10、15 min，退火延伸20、30 s）等条件进行摸索和优化，以达到最优组合。

1.6 敏感性试验

提取H7N9流感病毒RNA，用微量核酸分析仪测定病毒RNA含量。将RNA作10倍倍比稀释，取10.0 μL稀释后的RNA模板，加入到40.0 μL qRT-PCR预混液中，采用建立的荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定其灵敏度。

1.7 特异性试验

利用优化的实时荧光RT-PCR方法，分别检测H7N9（3株强毒和3株弱毒）、H5N6（5株）、H9N2（5株）等亚型流感病毒，以及新城疫病毒（2株）、禽传染性支气管炎病毒（2株）、传染性法氏囊病毒（2株）等常见禽类病毒，检验该方法的特异性。

1.8 与临床同类试剂盒的比较

以上述1.6中10倍比稀释的RNA为模板，对比本研究建立的方法与禽流感（AIV-H7）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）、禽流感病毒H7亚型实时荧光RTPCR检测试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）两种试剂盒的敏感性。以实验室分离测序确定的40株H7N9流感病毒（强毒株和弱毒株各20株）RNA为模板，对比该方法与两种试剂盒的特异性。

1.9 临床应用

对2015—2017年收集的临床疑似高致病性H7N9流感发病家禽样品20份（来自养殖场的鸡组织样品），利用建立的实时荧光RT-PCR方法进行检测，并将检测结果与病毒分离测序方法进行比较，检验该方法的准确性。

2 结果

2.1 单重实时荧光RT-PCR方法的建立

为验证实时荧光RT-PCR引物探针的设计，选取实验室保存的H7N9流感强毒和弱毒进行荧光RT-PCR检测，发现在单重实时荧光RT-PCR方法中，H7N9流感强毒和弱毒的引物探针均能有效检出所对应的病毒，且无交叉反应（图1）。

为进一步说明反应的特异性和准确性，将荧光RT-PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳和测序验证，发现H7N9流感强毒和弱毒均在约90 bp处看到1条特异性扩增条带（图2）。将扩增产物胶回收后连接TOPO载体测序，比对发现该扩增产物确实为H7N9流感病毒HA基因序列，表明本研究设计的H7引物特异性强，也说明该荧光RTPCR方法特异、准确。

2.2 实时荧光RT-PCR鉴别方法的建立及优化

图2 H7N9流感病毒实时荧光RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果

在实时荧光RT-PCR鉴别反应体系中，通过对反应体系中的不同引物、探针浓度组合扩增时反应参数和循环次数的条件摸索和优化，建立了鉴别H7N9流感强弱毒的实时荧光RT-PCR方法。经过反复优化和验证，发现实时荧光RT-PCR检测方法的最适引物浓度均为0.4 μmol/L，探针浓度均为0.3 μmol/L。实时荧光RT-PCR的最佳反应条件和循环参数为：第1阶段，反转录50 ℃/10 min；第2阶段，预变性95 ℃/2 min；第3阶段，95 ℃/10 s，60 ℃/30 s，40个循环。在第3阶段的每次循环退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果，以出现S型扩增曲线且Ct值≤38判为阳性。

2.3 实时荧光RT-PCR鉴别方法的特异性试验

利用建立的实时荧光RT-PCR方法，分别检测H5N6、H7N9、H9N2等亚型的流感病毒，以及新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒，发现该方法只能对应扩增H7N9流感强毒（3株）或弱毒（3株），对其他亚型禽流感病毒及其他禽病病毒扩增均为阴性（图3），表明该方法具有良好的特异性。

2.4 实时荧光RT-PCR鉴别方法的敏感性试验

图3 实时荧光RT-PCR鉴别方法的特异性试验结果

测定病毒的RNA浓度，将提取的RNA依次做10倍倍比稀释，每个稀释度取6 μL作为模板进行检测，以出现S型扩增曲线且Ct值≤38判为阳性。结果显示，该方法对H7N9流感强毒HA基因的检测下限是0.004 fg RNA模板，对H7N9流感弱毒HA基因的检测下限是0.1 fg RNA模板（图4）。

2.5 与其他试剂盒的对比

将上述1.6中的RNA依次做10倍倍比稀释，每个稀释度取6 μL作为模板，分别用两种商品化的H7亚型流感病毒荧光RT-PCR试剂盒与本研究建立的方法进行比较。结果显示，针对H7N9流感弱毒株，本方法比两种试剂盒的灵敏度均提高了10倍；针对H7N9流感强毒株，本方法与深圳匹基生物工程股份有限公司生产的试剂盒灵敏度相当，但比北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的试剂盒灵敏度提高了10倍（图5），说明该方法具有良好的敏感性。

图4 实时荧光RT-PCR鉴别方法的敏感性试验结果

以实验室分离测序确定的40株H7N9流感病毒（强毒株和弱毒株各20株）RNA为模板，对比该方法与两种试剂盒的特异性。结果显示，H7N9流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速检测方法可以将20份H7N9流感强毒和20份H7N9弱毒全部检出，检出率和符合率均为100%。两家公司生产的试剂盒虽然可以全部检出病毒，但不能区分强毒株和弱毒株。结果表明，本研究筛选的引物和探针能对目前的H7N9流感强弱毒株进行有效区分和检测。

2.6 临床样品检测

用上述H7N9流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速鉴别方法，对20份临床发病组织样品进行检测，结果检出4份强毒、3份弱毒（图6）。将20份组织样品研磨后接种10日龄SPF鸡胚，分离病毒；提取血凝阳性的尿囊液核酸，按照参考文献[3]中的方法，对HA基因进行扩增和测序，结果也显示为4份强毒、3份弱毒，二者检测结果一致，且为对应关系，符合率为100%，说明该方法具有良好的准确性。

3 讨论

图5 两种商品化H7亚型流感病毒荧光RT-PCR方法的敏感性试验结果

图6 该方法对临床组织样品的检测

对比H7N9流感强弱毒株HA基因序列发现，二者序列的差异主要体现在裂解位点处序列的不同。强毒株是在裂解位点处插入了12个碱基（编码4个氨基酸），并有多个碱基的突变，导致裂解位点处出现了多个碱性氨基酸，致使毒力增加[4]。本研究根据H7N9流感强弱毒株HA基因裂解位点及两侧区域的序列，设计1对通用引物及2条探针，对反应体系和反应参数进行优化后，建立了可以区分强弱毒的实时荧光RT-PCR鉴别检测方法。

该方法具有良好的特异性，可以区分H7N9流感强弱毒株，与H5、H9等亚型禽流感病毒以及其他禽病病原核酸，如新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒等均无交叉反应。该方法对H7N9流感强毒和弱毒HA基因的检测下限分别为0.004和0.1 fg RNA模板，敏感性优于深圳匹基生物工程股份和北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的同类商品化试剂盒。

常规RT-PCR方法虽然也可以检测H7N9流感病毒，甚至可以直接区分强毒株和弱毒株，但检测时间较长，需要电泳等开放的环节程序，容易对周围环境造成核酸污染。本研究建立的可以区分H7N9流感病毒强毒株和弱毒株实时荧光RT-PCR检测方法，具有特异性强、敏感性高等优点，对于H7N9流感的流行病学调查、监测、早期诊断和有效防控具有重要意义。