基于Txnip/NLRP3/NF-κB信号通路的芍药苷干预下半月板损伤修复的实验研究

钱 哲，缪文兴*，李林东，谢澄铖，黄桂成，马 勇，王建伟

（1.江阴市中医骨伤医院，江苏 无锡 214422；2.南京中医药大学骨伤研究所，江苏 南京 210023）

1 前 言

半月板损伤是由于外伤导致的不稳定和关节活动丧失引起的，它可导致疼痛或残疾、关节退化和骨关节炎症状[1-2]。膝关节半月板没有完全血管化，血液仅供给其结构的外三分之一，其自发修复的可能性有限[3]。大量研究表明半月板损伤与炎症途径密切相关，主要表现为体内炎症细胞因子水平的变化的变化，主要包括白细胞介素-1(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α (TNF子-α)，影响的途径主要有NLPR3和NF-κB[4-5]。炎症小体是一种大的多蛋白复合物，可作为白介素-1β和白介素-18的成熟胱天蛋白酶-1激活促发因子。它们根据其整体PRR家族成员的组成进行分类，这些成员作为支架蛋白促进胱天蛋白酶-1的募集、聚集和自动激活，最典型的炎症体是NLRP3炎症体。NLRP3既是支架蛋白，也是一种凋亡相关斑点样蛋白，含有半胱天冬酶募集结构域(ASC)衔接子和半胱天冬酶-1。各种刺激通过硫氧还蛋白相互作用蛋白（Txnip）会引起NLRP3炎性通路的活化，诱导IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的释放[6-7]。NF-κB是一种典型的促炎转录因子，含有p50/p65和IκBα。同时，研究表明NF-κB可以触发和调节下游促炎细胞因子的转录和表达[8]。芍药苷作为芍药的有效成分具有多种药理活性，包括抗癌、抗炎、抗肺纤维化抗痉挛作用[9]。然而芍药苷对半月板损伤修复作用的潜在机制尚不明确。因此，本研究旨在进一步探讨其在半月板损伤中的潜在机制。

2 材料与方法

2.1 试剂

芍药苷购自购自天津万象恒远科技有限公司(中国，天津)。白细胞介素-6、白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的酶联免疫试剂盒购自于南京科创生物技术公司 (中国，南京)。所有抗体均购自于Cell Signaling Technology (Danvers, USA)公司。

2.2 动物

动物60只成年新西兰雄性白兔购自北京维塔尔有限公司，并根据动物伦理委员会机构指南在GLP实验室的特定无病原体条件下饲养。动物被保存在常规的动物设施中，在22～24℃的恒定温度下，在12小时的光照/12小时的黑暗循环环境中。将家兔随机分为4组(每组15只)：正常组、半月板损伤（模型组）、模型组+芍药苷(20，40 mg/kg)组。除正常组和模型组外，芍药苷(20，40 mg/kg)组连续给药7天。除正常组外，其余三组均进行手术。所有的手术都是在同一个手术室进行的，使用的是标准操作程序。动物外科中心由两名资深外科医生组成。外科手术肌肉注射50 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg塞来昔布麻醉。刮除每只动物的双侧膝盖后，手术区域用碘/酒精消毒。在无菌条件下，前角和内侧半月板体。后腿的左膝通过一个完整的关节切口暴露出来。髌骨外翻允许关节最大程度弯曲。在半月板前部做了一个2.0毫米的斜切口。全楔形缺损。半月板组织的一小部分被切除，留下一个有缺陷的区域。

2.3 滑膜中细胞因子测定

按照ELISA试剂盒说明书检测各组别家兔滑膜中IL-1β、IL-6,TNF-α的含量。

2.4 半月板组织病理学

半月板组织固定在4%中性福尔马林溶液中。然后将组织包埋在石蜡中，切成4毫米厚的切片。进行苏木精-伊红染色，光学显微镜（200倍）下观察观察组织病理学变化。

2.5 蛋白质印迹

将组织置于含0.1%苯甲磺酰氟的冰冷RIPA缓冲液中溶解。总蛋白含量用BCA蛋白检测试剂盒定量。等量的蛋白用8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳加载。室温下，将从SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳转移的聚偏氟乙烯膜在脱脂乳中封闭2小时以上。然后将聚偏氟乙烯膜与适当浓度的特异性抗体在4℃孵育过夜。第二天，在用TBST洗涤三次后，将聚偏氟乙烯膜与第二抗体在室温孵育1小时。免疫反应带与增强化学发光(ECL)试剂盒相互作用，并在凝胶成像系统上可视化。

2.6 统计学分析

所有实验数据以均数±标准差表示，运用统计学软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 芍药苷对半月板损伤兔滑膜炎症细胞因子的影响

检测滑膜中IL-6、IL-1β及TNF-α的水平。结果如表1所示，半月板兔滑膜中IL-6、IL-1β及TNF-α水平明显高于正常组（P＜0.01）。芍药苷(20，40 mg/kg)能显著降低滑膜中IL-6、IL-1β及TNF-α水平（P＜0.01）。

表1 芍药苷对半月板损伤兔滑膜炎症细胞因子的影响(n=15)

3.2 芍药苷对半月板病理变化的影响

正常组兔半月板组织学分析观察正常组织和细胞结构。半月板损伤模型组表现为滑膜水肿、炎性细胞浸润和上皮变性。芍药苷(20，40 mg/kg)显著改善上述病理变化(图1)。

图1 芍药苷对半月板病理变化的影响(×200倍)

3.3 芍药苷对半月板Txnip/NLRP3/NF-κB通路的影响

与对照组相比，模型组 Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα水平升高（P＜0.01），Trx水平较低（P＜0.01）。与模型组相比，芍药苷(20，40 mg/kg)能够显著降低Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα水平（P＜0.01），升高Trx水平（P＜0.01）（图2）。

4 讨 论

半月板损伤会影响膝关节功能障碍。然而目前尚缺乏促进半月板愈合的有效治疗方法。虽然，关节镜下切除半月板撕裂仍然是最常见的治疗方法，但手术会导致膝关节表面暴露压力增加，影响骨关节炎进展[10]。芍药苷作为芍药的有效成分，具有多种药理活性[9]。然而芍药苷对半月板损伤修复作用的潜在机制尚不明确。因此，本研究旨在进一步探讨其在半月板损伤中的潜在机制。

图2 芍药苷对半月板Txnip/NLRP3/NF-κB通路的影响

TNF-α由单核细胞产生，具有免疫调节和炎症调节作用。IL-1β是一种与组织破坏或水肿有关的促炎细胞因子。IL-6具有多种免疫调节功能，可增强机体的免疫功能[11]。研究证实半月板损伤的病理过程中始终伴随着炎症[12]，而患有炎症时循环的促炎细胞因子可以引起膝关节滑膜的广泛变化，例如IL-6、IL-1β及TNF-α。本实验证实半月板损伤兔滑膜中炎症细胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α显著升高，芍药苷(20，40 mg/kg)显著降低滑膜炎症细胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α。

NF-κB是一种经典的促炎转录因子，参与调节促炎介质生成的最重要因子之一[13]。此外Txnip/NLRP3也是调节炎症的重要信号。本研究证实半月板损伤兔滑膜Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白表达水平升高，Trx蛋白表达水平降低。芍药苷(20，40 mg/kg)能够使Txnip、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κBp65和p-IκBα蛋白表达水平降低，Trx蛋白表达水平升高。综上所述，芍药苷对兔半月板损伤有抑制抑制炎症反应的作用，其机制主要与调控Txnip/NLRP3/NF-κB信号通路相关。