桦褐孔菌液体深层发酵菌株及配方优选研究

韩增华 杨洪博 戴肖东 马银鹏 陈贺 张丕奇*

（1黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨150010；2黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨150090；3东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）是十分珍贵的药用真菌，由于其药效显著，近年来遭到过度采摘，面临枯竭[1]。因其子实体与菌丝体内含有的成分和功效基本相当[2]，人们开始研究快速获得菌丝体及其产物，来替代濒临枯竭的野生桦褐孔菌。深层发酵技术因其发酵周期短、产品质量稳定、产物收率高及占地面积小等优点，逐渐获得认可[3-5]。20世纪末韩国开始使用深层发酵法生产桦褐孔菌多糖[6]，2004年我国开始相关研究[7-8]。桦褐孔菌液体发酵产菌丝及多糖量的变化受到诸如营养元素（氮源、碳源）和发酵条件等影响[9-12]，发酵培养获得活性物质其活性高于或相当于从子实体中提取的物质活性[13-15]。试验选用了5株桦褐孔菌菌株，通过单一碳、氮源比较，复合碳、氮源正交试验，最终利用较廉价发酵原料，筛选出菌丝干重和胞内、外多糖收率高的适宜大生产的桦褐孔菌菌株及及发酵配方，为大规模液体发酵生产桦褐孔菌菌丝体及其多糖提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试桦褐孔菌菌株

试验的5个桦褐孔菌菌株见表1，由黑龙江省科学院食用菌菌种保藏中心提供[16]。

表1 桦褐孔菌试验菌株

1.1.2 试验碳、氮源

碳源：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、CMC（羧甲基纤维素）、糊精、纤维二糖、CMC-Na（羧甲基纤维钠）。

氮源：蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、尿素、硫酸铵、硝酸钠、麸皮、酵母膏、KNO3、牛肉膏。

1.1.3 供试培养基

母种培养基cPDA：马铃薯200 g/L（煮汁1000 mL），琼脂粉14.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨0.5 g/L，磷酸二氢钾 3.0 g/L，硫酸镁 1.5 g/L，VB110.0 mg/L，pH自然。

发酵种子液培养基、菌株比较培养基：葡萄糖20.0 g/L，酵母膏 4.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

碳源试验培养基：碳源20.0 g/L，酵母膏4.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

葡萄糖复合碳源试验培养基：碳源10.0 g/L，葡萄糖 10.0 g/L，酵母膏 4.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

氮源试验培养基：氮源4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

酵母膏复合氮源试验培养基：氮源2.0 g/L，酵母膏 2.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L；H2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

1.2 试验方法

1.2.1 桦褐孔菌菌种的复壮

实验室保藏菌株用cPDA培养基转接2次，每次25℃培养10 d。

1.2.2 种子液培养

按配方配制种子液培养基，250 mL三角瓶装100 mL，110℃灭菌20 min，冷却后接入复壮的母种。每瓶用灭菌的自制接种针接种2.0 mm×2.0 mm大小的菌丝体10块，温度27℃，转速160 r/min，培养5 d，为发酵种子液。

1.2.3 菌球直径及菌丝体干重测定

将种子液按10%（V∶V）接种量转入各不同发酵培养基，温度27℃，摇床转速160 r/min，培养时间7 d，镜检无杂菌，布氏漏斗抽滤收集菌丝和发酵液，菌丝用ddH2O洗涤至滤液澄清，60℃干燥箱烘至恒重，称重为菌丝体干重。将发酵菌液倒入培养皿中，随机取20个菌球排成一行测量总长度，精确至1.0 mm，以菌球平均直径计算菌球的大小，3次重复。平均直径（mm）=菌球总长度（mm）/菌球个数（个）。

1.2.4 碳源、氮源筛选试验

按配方制备碳源和复合碳源培养基，氮源和复合氮源培养基，250 mL三角瓶装100 mL，接10%（V∶V）种子液，每个配方3次重复。摇床转速160 r/min，温度27℃培养7 d，镜检无杂菌后，布氏漏斗抽滤收集菌丝和发酵液。

观察记录菌球颜色、大小、菌球边缘整齐度、均一度、菌丝干重，测定菌丝体多糖和发酵液多糖，并进行差异显著性分析。

1.2.5 复合碳、氮源正交试验

在前期试验确定的摇瓶发酵培养最佳条件基础上，选用葡萄糖、麦芽糖、豆粉、酵母膏四个因素，设计了L9（34）正交试验（表2），以菌丝体干重为目标参数，结合胞内、外多糖含量，确定深层发酵的复合碳、氮源比例，筛选出高效发酵培养基配方。

1.2.6 多糖的提取测定

布氏漏斗抽滤发酵菌丝液，滤液部分80℃加热浓缩至1/4体积，加入4倍体积95%的乙醇，搅拌均匀，4℃沉淀过夜，8000 r/min离心10 min，去上清液，沉淀用无水乙醇洗涤2次，离心得沉淀，冷冻干燥得发酵液粗多糖。菌丝体60℃干燥至恒重，小型中药粉碎机粉碎，过120目筛，称取1.000 g，离心管中按体积比1∶5加入菌粉、双蒸馏水，冰浴超声5 s间歇5 s超声5 min，95℃水浴加热2 h，冷却后8000 r/min离心10 min，收集上清液，向离心管中加入双蒸馏水，重复上述操作，合并两次上清液，真空浓缩定容至20 mL。加入4倍体积95%乙醇，充分搅拌混匀，在温度4℃沉淀过夜，8000 r/min离心10 min，去上清，沉淀用无水乙醇洗涤2次，离心得沉淀，冷冻干燥得菌丝体多糖。多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[17]。

表2 深层发酵碳、氮源正交优化L9（34）设计因素水平

2 结果与分析

2.1 供试桦褐孔菌菌株的液体培养性状比较

5个供试桦褐孔菌菌株液体发酵结果见表3。由表3可见，供试菌株在菌球数量和菌球直径上差异不显著（P＜0.05），但在形态上有差别。In 4菌株菌球小而蓬松，数量多、生长快，大小均匀，发酵液颜色淡黄色，菌丝干重12.41 mg/mL，较In 1菌株高96%。其次是In 3菌株，除菌球直径较大外，与In 4菌株差异较小，菌丝干重是In 4菌株的92.8%。In 1菌株表现不佳，菌球大小不均匀、不规则，发酵液颜色最深，菌丝干重最低，与其他菌株差异显著（P＜0.05）。菌丝干重In 3菌株与In 4、In 5菌株差异不显著，与其他菌株差异显著（P＜0.05）。

In 4菌株发酵液多糖含量最高，达6.95 mg/mL，比In 1菌株高90%，In 1菌株发酵液多糖含量最低。In 2、In 3、In 5菌株发酵液多糖含量差异不显著，其他菌株间差异显著（P＜0.05）。菌丝体多糖含量最高的是In 3菌株，其次是In 4菌株，In 1菌株菌丝体多糖含量最低，仅是In 3菌株的62%，各菌株菌丝体多糖含量差异显著（P＜0.05）。综合发酵结果，In 4菌株优势显著，碳、氮源筛选用In 4菌株。

2.2 单一碳、氮源对菌丝干重的影响

液体培养结果见表4。由表4可见，纤维二糖为碳源菌丝体最多，其次是葡萄糖，果糖、麦芽糖再次之。CMC-Na为碳源菌丝少，菌丝干重仅为纤维二糖的21.3%。显著性分析表明，纤维二糖、葡萄糖为碳源两者菌丝干重差异不显著，与其他碳源差异显著（P＜0.05）。

表3 供试桦褐孔菌菌株液体培养性状比较

表4 单一碳、氮源对菌丝干重的影响（菌株In 4）

表5 复合碳、氮源对菌丝体收率的影响（菌株In 4）

豆粉作为氮源菌丝体干重大，但发酵后培养基中含有一定量的豆粉残渣，菌球收集清洗困难，大规模发酵不宜用豆粉。酵母膏为氮源效果也很好，KNO3为氮源无菌球生成，硝酸钠和尿素为氮源菌丝产量低。显著性分析表明：蛋白胨、牛肉膏菌丝体干重差异不显著，其他氮源处理间差异显著（P＜0.05）。考虑到纤维二糖成本高，豆粉残渣处理问题，因此以葡萄糖和酵母膏为基础碳、氮源与其他碳、氮源进行复合碳、氮源筛选。

2.3 复合碳、氮源对菌丝干重的影响

葡萄糖、麦芽糖培养基菌丝体最多，达16.35 mg/mL，其次是纤维二糖，这2个复合碳源配方菌丝干重均高于对应的单一碳源组。果糖、可溶淀粉、乳糖复合碳源的菌丝干重低于对应的单一碳源的菌丝干重，其他复合碳源处理组菌丝干重都高于对应的单一碳源组，CMC-Na复合碳源菌丝干重最低。

酵母膏、黄豆粉复合氮源菌丝干重高于单一酵母膏氮源组，且发酵后培养基中豆粉残渣几乎看不见，便于菌丝清洗。除蛋白胨复合氮源组菌丝干重略低于其对应的单一氮源组外，其他复合氮源菌丝干重均高于对应的单一氮源。

显著性分析表明，果糖、CMC复合碳源组间菌丝干重差异不显著，其他复合碳源处理差异显著（P＜0.05）。牛肉膏、酵母粉复合氮源组菌丝干重差异不显著，其他处理组菌丝产量差异显著（P＜0.05）。试验筛选的复合碳源为葡萄糖、麦芽糖，复合氮源为黄豆粉、酵母膏，确立了正交复合配方筛选4因素。

表6 复合碳、氮源L9（34）正交试验结果（菌株In 4）

2.4 复合碳、氮源L9（34）正交试验

L9（34）正交试验结果见表6。由表6可见，3、7、8组菌球数量多，直径小，颜色淡，菌球均匀。1组菌球直径大，菌球大小不均，颜色深。5组菌球数也较少。菌丝干重第9组最高，达22.04 mg/mL，发酵液多糖最高达11.3 mg/mL。其次是第8组，菌丝收率20.66 mg/mL，菌丝体多糖含量最高达136.9 mg/g，1组发酵产物收率最低，菌丝干重、菌丝体多糖和发酵液多糖分别是9组的31%、30%和38%。差异显著性分析表明：第9组除与8组菌丝多糖差异不显著外，在菌丝干重和发酵液多糖含量上较其他组差异显著，其他各组间差异显著（P＜0.05）。正交组合分析：4因素中以A因素（麦芽糖）级差最大，其对发酵菌丝体产量的影响最大，C因素（酵母膏）的影响最小。最优条件是：A3B3D1C2，即1.5%麦芽糖，1.5%葡萄糖，0.2%酵母膏及0.06%的豆粉效果最佳。

3 小结与讨论

桦褐孔菌野生资源短缺，解决这一问题已经迫在眉睫，除了加大人工栽培技术研究力度外，液体发酵技术生产桦褐孔菌菌丝体是解决桦褐孔菌原材料不足的重要途径[18]。

黄玲对2个桦褐孔菌菌株的发酵比较发现，两菌株的菌丝体及粗多糖产量差异极显著[19]，这一结果与本研究相符合。供试5个菌株间无论是发酵培养菌丝体性状，还是发酵产物产量上差异明显。In 4菌株发酵性状表现优良，菌丝产量最高，菌丝干重与除In 3菌株外其他菌株差异显著，而发酵液多糖和菌丝体多糖均高于供试其他菌株且差异显著（P＜0.05）。

桦褐孔菌能利用的碳源较多，单糖、双糖、大分子化合物均可，而氮源中有机氮源远远优于无机氮源，可能是有机氮中含有丰富的蛋白质、多肽、游离的氨基酸以及少量的脂肪、微量元素和生长素等，有利于菌丝体的生长和各种代谢产物的合成[20]。研究开展单一成分和复合碳、氮源筛选，目的是考察不同营养及多重营养因素下，尽可能地获得最多发酵产物。不同的碳、氮源，菌丝体的生长及各种代谢产物的合成量有影响，无论是以培养桦褐孔菌菌丝体还是以多糖产量为目的，都可以筛选出廉价易得的培养原料。研究中纤维二糖为单一碳源菌丝干重虽高，但是成本较高，不适用于大生产。豆粉虽然廉价但残渣处理困难，作为有机氮，可减少用量来满足高效发酵之需。研究在单一碳、氮源筛选基础上，完成两组碳、氮源复合配方正交试验，获得一个高产配方：麦芽糖15.0 g/L，葡萄糖15.0 g/L，豆粉 0.6 g/L，酵母膏 2.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO41.5 g/L，VB110 mg/L，起始pH4.0。该配方发酵周期7 d，获得菌丝干重22.0 mg/L，发酵液多糖11.3 mg/L，菌丝体多糖132.2 mg/L，试验结果为大规模生产应用提供理论依据。